多肽合成包括液相多肽合成（solution phase synthesis; SPS）和固相多肽合成（solid phase peptide synthesis; SPPS）两种不同概念的方法。虽然二者都有从C-端到N-端或者N-端到-C端方向进行组装的报道，但固相多肽合成更倾向于从C-端到N-端来进行缩合反应。

液相多肽合成通常是在有机溶剂体系中进行缩合反应，每完成一步缩合反应后都需要进行一次分离纯化的操作，通常用于合成短肽，并在工业化生产短肽中被广泛使用。固相多肽合成是最有效的多肽合成方法。该技术的关键是使用了不溶性的固相树脂作为载体，从而使得每步的反应产物能够始终附着在树脂上面，避免了反复的分离纯化操作。此外，在固相合成技术的基础上衍生出的蛋白多肽片段的连接方法，是将较大的目标蛋白分成适当的几个多肽片段分别合成，再在溶液中将其连接起来。

1901年，德国化学家E.费歇尔首先在溶液中合成了甘氨酰甘氨酸二肽（图1），开启了多肽化学合成的研究。进入20世纪中叶，伴随着多肽合成方法和保护基等方面的发展，人们在有机溶剂中成功地合成一些生物活性肽，如催产素、胰岛素等。1963年，B.梅里菲尔德提出了固相多肽合成方法，并使用叔丁氧羰酰基（tert-Butoxycarbonyl; Boc）来保护α-氨基。1966年，梅里菲尔德发明了第一台自动固相多肽合成仪，使得多肽化学合成得到了突飞猛进的发展。1971年，以芴甲氧羰基（fluorenylmethyloxycarbonyl; Fmoc）来保护α-氨基的固相多肽合成策略被提出，采用了比Boc法更温和的脱保护方案，显著增强了多肽合成的效率，进一步推动了固相合成技术的发展。Fmoc化学已成为多肽合成的主流方法，而新的多肽合成技术如微波合成技术、Flow-based多肽合成技术以及多通道全自动多肽合成仪的出现，使得人们能够以更快的合成速度获得更高的合成通量。

图1 费歇尔合成二肽

是酰胺肽键形成的过程（图2），即通过一个氨基酸的氨基亲核进攻活化的另一个氨基酸的羧基部分形成肽键。常见的活化与缩合试剂有二环己基碳二亚胺（dicyclohexylcarbodiimide; DCC）和二异丙基碳二亚胺（diisopropylcarbodiimide; DIC）等，针对碳二亚胺碳上的羧酸氧的亲核攻击形成的高反应活性O-酰基异脲中间体，促进了后续的酰胺生成。如果参与肽键形成的其他官能团未加保护，则形成肽键后的终产物会变得复杂，可形成如线型肽或环肽的其他副产物。因此，在合成多肽过程中，对这些官能团都需以临时的方式加以保护，从而获取高纯度目标产物。

PG：保护基图2 肽键形成过程

为了减少氨基酸α-碳消旋的发生，固相法制备多肽一般采用从C-端到N-端合成的策略。肽键的形成过程通常包括下面3个步骤：①制备α-氨基与侧链官能团被保护的氨基酸原料；②保护的氨基酸在缩合剂的作用下转化为氨基酸的活化氧酯或者活化酰胺，并随即与另一氨基酸的自由氨基发生反应生成酰胺键；③在目标多肽合成完毕后，在强酸性试剂处理下，固相上保护的氨基酸脱去保护基并转变为目标多肽。

根据解保护的难易程度，保护基可分为临时保护基和半永久性保护基。临时保护基主要用于暂时性的保护下一步将参与反应的氨基酸的氨基或羧基基团，半永久性保护基主要用于保护氨基酸的侧链。半永久性保护基在目标序列完成合成之后将被去除。从缩合反应的原理可以看出，N-末端保护基和侧链官能团保护基的选择是固相合成多肽的关键。

除甘氨酸外，α-氨基酸通常为手性分子。因此，对于直接连在α-氨基酸手性中心的官能团来说，如果它们所参与的反应发生消旋，则意味着多肽分子部分或全部立体化学信息的缺失。鉴于多肽分子生物活性与其立体结构有直接关系，因此，多肽合成中要尽量避免消旋。主链保护基须满足：①与氨基酸侧链保护基是正交的；②在合成过程中不能促使氨基酸的消旋。侧链保护基对氨基酸侧链上活性官能团如羧基、酰胺、巯基等的保护是多肽合成中克服氨基酸缩合消旋问题的关键。此外，为减少多肽合成中的消旋化，人们发展了诸如1-羟基苯并三唑（1-hydroxybenzotriazole; HOBt）、1-羟基-7-氮杂苯并三唑（1-hydroxy-7-azabenzotriazole; HOAt）以及最新一代氰基羟基亚氨基乙酸乙酯〔ethyl 2-cyano-2-(hydroxyimino)acetate; oxyma〕等外消旋抑制剂，作为碳二亚胺偶联反应中的添加剂。

固相多肽合成的每一个重复性合成循环都从脱去氨基酸的N-末端保护基开始。对于固相和液相多肽合成来说，对酸不稳定的叔丁氧羰基或对碱不稳定的9-芴甲氧羰基是最佳的临时保护基。鉴于N-末端保护基的临时保护性质，正确选择氨基酸的侧链半永久性保护基及连接臂非常重要。

常用的多肽合成策略包括Boc/Bzl/HF方法和Fmoc/tBu/TFA方法。Boc体系采用对酸敏感的Boc作为α-氨基的保护基，使用三氟乙酸（trifluoroacetic acid; TFA）脱除临时性保护基，而侧链的保护基（苄醇类）需要对三氟乙酸稳定，并以氟化氢（hydrofluoric acid; HF）进行最后的裂解处理。与Boc法不同，Fmoc方法采用对碱敏感的Fmoc作为α-氨基保护基，使用哌啶溶液脱除临时性保护基，侧链保护采用叔丁基类保护基，以TFA进行最后的切割。Boc法中使用的TFA能够防止活性氨基被多肽链包埋，因而通常能合成较长的多肽。但是，Boc法需要使用高度危险的HF，同时HF的强烈化学活性对一些结构脆弱的多肽不利，这些问题限制了Boc法的应用范围。Fmoc法的裂解条件温和，但是随着链长的增加，活性氨基可能被包埋，因此Fmoc法合成长肽的效率可能比Boc法低。下表总结了一些代表性氨基酸在Fmoc或Boc策略下所优先使用的侧链保护基。