《证类本草》问世以后的500余年间，积累了大量用药经验，产生了许多药学著作，需要加以汇集总结。《证类本草》粗略的分类系统和时代分层式的编写体例已难以适应归类、检索众多药物的需要。《本草纲目》出色地解决了以上问题。李时珍充分汲取了历代本草的编纂经验，在保留标注引文出处等优良传统的基础上，对古本草旧分类法进行变革，即采用了“不分三品，惟逐各部；物以类聚，目随纲举”的多级分类法。全书药物以十六部为纲，六十类为目。各部又按“从微至巨”“从贱至贵”为序进行排列。每一药物以正名为纲，附品为目，“标名为纲，列事为目”，形成该书独特的纲目体系。这一体例不仅方便检索，而且创新性地建立了较先进的药物分类系统。

受陈藏器《本草拾遗》的影响，李时珍确定了该书收载药物“不厌详悉”“虽冷僻不可遗”的原则。因此李时珍从800余种文献中广泛搜集药物资料，补充药品374种，极大地丰富了中药学内容，完成了明代药物集大成的历史任务。与《证类本草》不同，《本草纲目》并不局限于汇集资料，特别注重反映作者个人的新见解，尤其是在药物品种考订方面成果累累。受儒家格物穷理及金元时期张元素、李东垣医学思想的影响，该书在药学理论系统归纳和探讨方面也颇有建树。

该书所载药品众多，取材广博，其中也包含了相当丰富的自然科学（动物学、植物学、矿物学、化学等）知识。据考，英国生物学家达尔文在讨论鸡的变异、金鱼的育种家化时均引用了《本草纲目》的资料，并称它为“古代中国的百科全书”。2011年入选《世界记忆名录》。

《本草纲目》约初刊于万历二十一年（1593，金陵胡承龙刻本），成为明末以后许多药学著作的资料源泉，产生了近百种后续性本草学著作，如《本草纲目拾遗》《本草原始》等。该书至今已翻印80余次，并东传日本，对日本的药学、植物学发展起了很大的推动作用。人民卫生出版社在1977～1981年出版了刘衡如校点本，是较为精确的排印本。近有金陵本刊行。《本草纲目》还有英、德、俄、法等多种语言文字的节译本与英文全译本刊行。