生于马其顿托莱索，卒于君士坦丁堡。出身低下，父亲是拜占廷帝国巴尔干半岛达尔达尼亚行省贝德里亚纳的农民。青年时代因家境贫苦，随舅父查士丁从军。518年查士丁一世称帝后，因年老无子，收查士丁尼为养子，并委以要职。525年，查士丁尼获“凯撒”称号。其间，作为帝国军政大计的实际制定者，积极推行“清除内患、化解外争”的政策，处死对皇权造成最大威胁的贵族领袖塞奥克里多斯和维塔里安。同时，取消前任皇帝的宗教政策，重申对《尼西亚信经》正统教义的支持，暂时消除了因宗教争论造成的社会动荡。对外主动结好西部教会，邀请罗马教区大主教访问君士坦丁堡，并与波斯保持友好关系。

527年4月，查士丁尼与查士丁一世为共治皇帝，称“奥古斯都”。527年8月1日查士丁一世死后，查士丁尼成为帝国唯一的皇帝，统治拜占廷帝国30余年。执政期间，在法律方面，推行“重建罗马大帝国”的政策。529年，颁布《查士丁尼法典》；530年，颁布《法学汇编》；533年，颁布《法学总论》。此后，又陆续颁布了168条法令，565年被编辑成集，称为《新律》。查士丁尼时代汇集整理的全部法律文献，统称为《罗马民法大全》，成为欧洲历史上第一部系统完整的成文法典。经济方面，通过立法废除包税制，从原有的实物税变为实物和货币混合税。同时，加大对等级税的征收，以打击日益兴起的大土地贵族势力，并严厉限制教会地产；建立东西方之间直接的商业往来，与波斯争夺红海贸易控制权，以及从中国引进育蚕丝织技术等。宗教方面，推行基督教化政策，利用基督教作为其专制政体的精神支柱。上台不久即宣布自己是基督教的保护者，首要责任是根绝一切异端。他限令所有持非正统教义的信徒在三个月内皈依国教，否则剥夺其政治和宗教信仰权，并以重税和劳役实现经济上的迫害。兴建教堂和修道院，并于553年在君士坦丁堡召开基督教大公会议，试图制止宗教争端造成的社会分裂。军事方面，发动多次对外战争，包括汪达尔战争、哥特战争以及波斯战争。541年后，爆发“查士丁尼瘟疫”，严重削弱了帝国。

死后无子嗣，王位由查士丁二世继承。