比率荧光探针与待测样品反应后，出现激发或发射光谱位置的变化或光强度的改变，利用不同波长处荧光强度的比值进行定量检测。通过双激发或双发射体系，比率测量可以有效减少或消除几种决定因素的变化对测量荧光强度的影响，包括探针浓度、激发光的光路长度、激发强度和检测效率，消除的人工假象包括光漂白、探针渗漏、样品（细胞及组织）厚度、探针在细胞或组织内的负载和留存变化。因此，比率荧光成像能够显著提高检测的选择性和灵敏度，而且可用来准确定量检测，在生物成像检测领域得到了广泛的应用。