这类方法不需要依赖核酸标准品，可以将核酸定量测量结果溯源至自然单位1。根据其原理可以分为基于微流控技术的数字聚合酶链式反应（PCR）方法和基于流式技术的单分子计数方法。实现准确定量的前提是样品溶液中的目标核酸分子满足泊松分布，因此都需要将样品稀释至合适的浓度范围，浓度过高，由于不满足泊松分布而导致定量结果不准，如果浓度过低，由随机效应引起的误差较大，导致测量结果分散性大。

将荧光染料嵌合进入核酸分子中，激光激发后发出荧光，通过流式技术使得结合了荧光染料的核酸分子通过检测器，从而被一一记录下来，实现对起始样本中的核酸定量。这种技术最早报道是关于通过对DNA片断的测量实现对细菌的鉴定。2009年，韩国标准科学研究院（KRISS）首次系统研究了单分子计数方法定量测量噬菌体基因组DNA，提出单分子计数方法可作为基于计数的DNA定量参考方法。

通过将PCR反应分散到几千至几万或上百万的小室内，使每个反应小室内不含或含有一个核酸分子，然后进行PCR扩增。通过荧光检测器读取扩增后每个反应小室的荧光信号强度来判断含有目标核酸分子（阳性反应）的小室的个数，基于泊松分布，根据反应小室的总数、每个反应小室的体积以及稀释因子，可计算出起始样本中的核酸分子数，实现对起始核酸浓度的绝对测量。

根据形成反应小室形式的不同可分为微滴数字PCR仪和微流控芯片数字PCR仪。反应小室的体积由皮升级至纳升级不等，微滴数字PCR仪以美国伯乐公司的QX100和QX200为代表，芯片数字PCR仪以富鲁达公司的BioMark为代表。