格丁根马普生物物理化学研究所S.W.赫尔(Stefan W. Hell,德国,1962~ )等人于20世纪90年代开发的受激发射光淬灭显微技术,S.W.赫尔也因此被授予2014年诺贝尔化学奖。
传统光学显微镜的分辨率受光衍射极限的限制,在可见光范围内。传统光学系统的横向分辨率仅为200纳米,而大部分亚细胞器官要小于100纳米,因此衍射极限的存在限制了传统光学显微镜在单细胞、亚细胞和单分子层次研究中的应用。受激发射光淬灭显微技术(stimulated emission depletion microscopy,STED)通过受激发射效应选择性地使荧光失活,并减小有效荧光发光面积。利用该技术比传统的共聚焦显微镜有更好的系统分辨率。
STED技术的原理是第一束激光(激发光)用于激发荧光分子,第二束激光(淬灭光)将激发光斑焦点外围的荧光淬灭,只有焦点中心能检测到荧光,故STED显微镜的分辨尺度由激发光斑的大小缩小到焦点中心的大小,荧光有效发光面积显著减小,系统分辨率从而提高。实现该技术的关键在于:①合理调控淬灭光光斑形状,把有效荧光区域限制在小于衍射极限范围内,进而减小有效荧光发光面积。②利用荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系,合理增大淬灭光的强度,缩小有效荧光发光面积。
与其他超高分辨显微技术相比,STED技术的特点主要有:①STED为点扫描成像,可以快速地观察活细胞内实时变化的过程,已经可以达到视频速度。②无需数据处理,直接成像,可靠性更高。STED技术的应用仍存有一定的缺陷,如光路复杂,设备昂贵,对系统的稳定性要求很高。另外,只能选用特定的染料,并使用高强度的第二束激光,也限定了它的应用范围。
随着STED技术的发展,该技术已广泛应用在生物分子的结构分析、活细胞和体细胞检测与病毒分析等方面。