荧光显微术通常观察的标本用荧光色素或蛋白染色，以紫外或可见光为激发光源。荧光是指荧光色素或蛋白吸收激发光后，发出的一种比激发光更长波长的光。在生物学研究中，荧光探针被广泛地用来标定生物分子，使荧光显微术变得越来越重要。

用于实现荧光显微术的仪器被称为荧光显微镜。荧光显微镜由光源、滤光片和光学系统等主要部件组成。光源发出激发光通过物镜聚焦在样品上，样品吸收激光发出荧光，荧光通过收集光路被光电探测器采集。虽然大部分激发光会透射过样品或者被样品吸收，但是还是会有少数的反射激发光会和荧光混合在一起。收集光路中的特定滤光片，将反射的激发光与荧光分离，保证荧光显微镜具有较高的信噪比。

荧光显微术主要包括落射荧光显微术、共聚焦荧光显微术、全内反射荧光显微术和超分辨荧光显微术。落射荧光显微术结构比较简单，入射光和荧光都通过同一个物镜，弱化了激发光对荧光的干扰，是其他荧光显微术的基础。共聚焦荧光显微术采用空间针孔调制去除样品非焦点平面的散射光，光学分辨率和视觉对比度都得到了提高。全内反射荧光显微术利用光线全反射后产生的隐失波特性，在极薄区域观察荧光标定样品，降低了背景光噪声的干扰。超分辨荧光显微术突破了光学显微的极限分辨率，将荧光显微术的空间分辨率提高到纳米量级。

荧光显微术对光源有着较高的要求。主要有四种：氙气灯或带有带通滤光片的水银灯、激光、超连续光谱光源和高功率发光二极管。氙气灯、水银灯和发光二极管通常用于一般的落射荧光显微术。激光则常见于共聚焦显微术、全内反射荧光显微术和超分辨荧光显微术。

荧光探针的化学特性一定程度上限制了荧光显微术的应用。首先，荧光显微术只能对特定的生物结构或分子进行荧光标记。其次，荧光基团在受激放射荧光的过程中，会不断地积累化学损伤从而丧失发出荧光的能力，这一现象被称作光漂白。光漂白的存在限制了荧光显微术的观测时间。最后，荧光显微术经常用于观测分析活体细胞，但是短波长的激发光具有较强的光毒性，而活体细胞对光毒性敏感。此外，荧光分子在光照射下会倾向于生成活性化学物质，从而进一步增强光毒性。但是，随着各种功能强大的荧光探针的快速发展，荧光显微术的生物应用范围在不断地扩大。

荧光显微术已经成为重要生物光学显微技术之一。主要用于研究组织或者细胞内物质的吸收、运输，化学物质的分布及定位等。例如分子马达的运动、活细胞中分子成像、生物大分子的相互作用、生物大分子的构象变化、三磷酸腺苷（ATP）酶反应、单分子的电子转移反应等研究领域。