由于其作用于细菌的细胞壁，对人几乎没有毒性，是一类抗菌活性强、毒性低、临床疗效好的抗生素。

天然青霉素类以青霉素G为代表，是窄谱的、不耐酶的青霉素。对革兰阳性菌包括不产β内酰胺酶葡萄球菌属、β溶血性链球菌、敏感的肺炎链球菌、多数草绿色链球菌、各种致病螺旋体及放线菌属、脑膜炎奈瑟球菌、大多数牛放线菌等均具高度活性。对不产β内酰胺酶葡萄球菌属、链球菌属、炭疽芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌属、白喉棒状杆菌及革兰阳性厌氧杆菌（破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌、乳酸杆菌等）、回归热螺旋体、梅毒螺旋体、钩端螺旋体、念珠状链杆菌、多杀巴斯德菌、小螺菌、淋病奈瑟球菌等皆敏感。对肠球菌属、嗜血杆菌属、嗜肺军团菌、产黑素拟杆菌和其他拟杆菌属呈中度敏感，亦有高度耐药者。对产β内酰胺酶的流感嗜血杆菌和淋病奈瑟球菌、肠杆菌科细菌、布鲁菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、弯曲杆菌属、脆弱拟杆菌、诺卡菌属、真菌、原虫则耐药。对分枝杆菌属、衣原体属、支原体属、立克次体等无作用。

耐酶青霉素类对β–内酰胺酶稳定，主要有甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、奈夫西林等。对产青霉素酶和不产青霉素酶的金葡菌具抗菌活性。对化脓链球菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟球菌、草绿色链球菌具良好抗菌活性。对青霉素敏感葡萄球菌和链球菌的抗菌活性明显较青霉素为差。肠球菌属、耐甲氧西林金葡菌、革兰阴性杆菌对该类药物耐药。

广谱青霉素类包含氨基青霉素和羧基青霉素。对化脓性链球菌、肺炎链球菌、无乳链球菌、青霉素敏感金葡菌、草绿色链球菌具较强活性。淋病奈瑟球菌高度敏感，但产酶株完全耐药。宋内志贺菌、非伤寒沙门菌属、沙雷菌属、多数克雷伯菌属、不动杆菌属、普通变形杆菌、铜绿假单胞菌、脆弱拟杆菌呈现耐药。

青霉素类吸收后可广泛分布于全身，在组织和某些分泌液如关节液、胸膜液、心包液和胆汁中皆易达到治疗浓度。然而，前列腺分泌液、脑脊液及眼内液中的含量很少。脑脊膜发炎时脑脊液中浓度增加，可高达血浆浓度的5%。青霉素类主要通过肾小球滤过和肾小管分泌，半衰期较短，通常为30～60分钟，在尿中浓度很高。

青霉素类抗生素的毒性很小，但过敏反应在各种药物中居首位，发生率为0.7%～10%。常见者为皮肤反应，表现有皮疹、血管性水肿，严重者为过敏性休克，多在注射后数分钟内发生，抢救不及时可造成死亡。各种给药途径或应用各种制剂都能引起过敏性休克，但以注射用药的发生率最高。过敏反应的发生与药物剂量大小无关。对该类高度过敏者，虽极微量亦能引起休克，因此该类药物使用前必须做皮试。