最初建立的放射免疫分析技术属于竞争抑制标记免疫分析法，其反应原理是：在同一反应体系内，一定量的标记抗原（已知）与非标记抗原（未知/待测物）竞争结合限量特异性抗体，同时形成带有标记的抗原-抗体复合物和不带有标记的抗原-抗体复合物，经沉淀、分离等步骤后，通过检测带有标记的抗原-抗体复合物的量，推算出未知待测物的量。此时待测物的量与测得的标记抗原的量呈负相关（图1）。

图1

竞争抑制标记免疫分析法多采用免疫动物得到的多克隆抗体为特异性结合物，抗体的特异性、不同动物个体差异的影响等因素导致了其局限性。

随着单克隆抗体技术的发展，以双抗体夹心检测一个抗原的方法——“免疫放射分析（immunoradiometric assay; IRMA）”应运而生，此方法又称为“双位点（two site）夹心法”或“三明治（sandwich）夹心法”。免疫放射分析是最早出现的非竞争性标记免疫分析，其基本特征是：将放射性核素标记在抗体上，整个反应体系中，有两株对某一特定抗原的不同活性位点能发生免疫反应的抗体。一株抗体包被于固相表面（用于分离），另一株抗体标记放射性核素（用于检测）。待测抗原的一个活性位点与固相抗体结合，另一个活性位点与标记抗体结合，形成“固相抗体-抗原-标记抗体复合物”。此时抗体是过量的，检测到的复合物与待测抗原浓度的量呈正相关（图2）。免疫放射分析法具有以下特点：①以标记抗体作为示踪剂，而抗体为蛋白质，有利于碘化标记，不同抗体标记方法基本相同，标记抗体的比活度高，可以提高分析灵敏度。②在反应动力学方面，由于标记抗体是过量的，反应是非竞争性的，抗原抗体是全量反应，达到反应平衡时间比RIA（放射免疫分析）快，反应更充分。在RIA中抗体量是微量的，所以一定要用高亲和力的多克隆抗体，而IRMA应用亲和力较低的单克隆体也能得到满意的结果。③RIA是竞争抑制反应，测得放射性信号与被测抗原呈反比。IRMA为非竞争结合，剂量-反应曲线为正相关。④IRMA一般选用针对不同位点的两株单克隆抗体，其交叉反应率低于应用多克隆抗体的RIA，相应特异性、灵敏度均有提高，剂量-反应曲线工作范围更宽，可达3个数量级以上。⑤IRMA反应中标记抗体和包被抗体在反应中都是过量的，只有被测标本的加样误差才会影响分析结果。理论上讲，IRMA的反应误差更小。⑥RIA使用免疫动物得到的多克隆抗体，而IRMA使用两株针对被测分子两个不同表位的单克隆抗体。因此，RIA可以测定大分子量与小分子量的物质，而IRMA只能测定在分子上具有2个以上抗原表位的物质。

双抗体夹心检测方法的巨大优势，导致其在后期技术发展中得到广泛应用。在标记物选择、抗体优化、分类方法等方面不断改良、应用和更新，衍生出多种标记免疫分析方法，形成标记免疫分析学科。标记免疫分析技术应用非常广泛，具有抗原性质的体内微量物质如：激素、蛋白质、多肽、糖蛋白及其代谢产物、代谢药物等均可以此方法被测量。

1959年，R.S.耶洛和S.A.伯森（Solomon A.Berson）在研究胰岛素（Insulin）和胰岛素抗体的免疫学反应时，首次将放射性同位素（125I）作为标记示踪物的“高灵敏性”与抗原-抗体特异结合的免疫反应的“高特异性”的特点相结合，完成了人血清胰岛素的定量分析，建立了对体内微量物质定量测量的放射免疫分析法（RIA）。为此，两位学者获1960年诺贝尔生理学或医学奖。

基于单克隆抗体技术，1968年Miles和Heles首次创立了双位免疫结合，即免疫放射分析（IRMA），在之后的免疫分析中取得广泛应用。

放射免疫分析（RIA）和免疫放射分析（IRMA）。基本原理：根据抗原抗体特异性结合的原理，以放射性同位素标记抗原或抗体，根据射线的多少定性或定量测定待检标本中抗体或抗原的量。

酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA）。基本原理：指酶标记抗原或酶标记抗体进行的抗原抗体反应，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。1971年瑞典学者Engvail和Perlmann，荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法（ELISA）。

胶体金免疫技术（Colloidal gold immun techniques; CGIA）。基本原理：以胶体金作为示踪标记物，主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点。

胶体金免疫技术是于1971年建立的一种信号显示技术。最初用于免疫电镜检查，由胶体金颗粒标记抗原或抗体，与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合，在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后，利用硝酸纤维素膜（NC）等为固相载体，以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行，建立快速检测的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术，实现了免疫学检测中的POCT。

荧光免疫分析（fluorescence immunoassay; FIA）。基本原理：以荧光素标记抗体或抗原作为示踪剂的一种新的免疫分析技术，其原理与ELISA相似。该法既可对液体中的抗原和抗体定量，也可对组织切片中的抗原、抗体进行定性和定量。一般由于样品、试剂的自身荧光和激发光的散射，本底荧光高，影响了测定的灵敏度。一般以镧系元素作为荧光标记（示踪剂）。示踪剂与相应抗原或抗体结合后，借助荧光检测仪察看荧光现象或测量荧光强度，从而判断抗原或抗体的存在、定位和分布情况或检测受检标本中抗原或抗体的含量。

化学发光免疫技术（Chemiluminescence immunoassay; CLIA）。基本原理：利用化学或生物发光系统作为抗原抗体反应的指示系统，借以定量检测抗原或抗体的方法，发光物质可直接作为抗原抗体的标记物，也可以游离形式用于催化剂（酶）和辅助剂标记的抗原或抗体的发光反应中。

放射免疫分析由于敏感度高、特异性强、精密度高，并可测定小分子量和大分子量物质，所以在医学检验中应用广泛，常用于测定各种激素（如甲状腺素、性激素、胰岛素等）、微量蛋白质、肿瘤标志物[如甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、CAl25、CAl99等]和药物（如巴比妥、氯丙嗪）等。

由于放射性核素对人体有危害，需要特殊防护，放射性实验室建设须经防疫部门监督，操作人员需要特殊培训，并且放射性核素有半衰期，试剂盒货架寿命较短，所以说放射免疫分析在实际应用中有诸多不便。随着标记技术的发展，放射免疫分析正在被非放射性标记技术及其产品所取代。

图2 人民解放军海军总医院化验员刘忠（左）在有关人员协作下，研究制备出可供全国医院使用八至十年的胰岛素抗体血清