气态原子和物质分子受电磁辐射（一次辐射）激发后，能以发射辐射的形式（二次辐射）释放能量返回基态。这种二次辐射称为荧光或磷光，测量由分子发射的磷光强度和波长所建立的方法叫作分子磷光光谱法。

在低温磷光法（LTP）首次获得应用之后十年，即1967年，随着罗思（Roth）的研究，诞生了磷光光度分析的另一种新的方法——室温磷光法（RTP）。RTP法具有操作简便迅速、取样量少、灵敏度高、选择性好、易于自动化的特点。适用于有机药物及生物药物的痕量分析。

根据玻尔兹曼分布，分子在室温时基本上处于电子能级的基态，当吸收了紫外-可见光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发单重态的各个不同振动-转动能级。无论分子最初处于哪一个激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上，这时发射的光量子称为荧光。分子的第一电子激发单重态的最低振动能级与第一电子激发三重态的最高振动能级重叠发生体系间跨越，经过体系间跨越的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级。分子在激发三重态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出光辐射，即磷光。