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等电点测定

/determination of isoelectric point/
条目作者李响

李响

最后更新 2022-12-23
浏览 206
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采用理化方法,对蛋白质类和肽类等两性化合物等电点的分析检测。

英文名称
determination of isoelectric point
所属学科
现代医学

生物技术药的等电点分析检测通常采用浊度分光光度法、等电聚焦电泳法等。

配制不同pH的缓冲溶液,分别加入等量待测蛋白质。由于蛋白质在pH为其等电点的缓冲溶液中溶解度最小,用分光光度仪检测浊度最高的缓冲溶液的pH为蛋白质的等电点值。

通过专有的电泳仪器,用两性电解质在电泳场中形成一个稳定的pH梯度,蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移,当到达其等电点时,电流达到最小,不再移动,与等电点标记物的电泳行为相比较,以各标准品的等电点对其相应的迁移距离做线性回归,将供试品的迁移距离代入线性回归方程,计算等电点值。

用于等电聚焦电泳的仪器有等电聚焦电泳仪、毛细管电泳仪等,其中等电聚焦电泳仪可分为水平板式和垂直板式,电泳载体通常为聚丙烯酰胺凝胶。毛细管电泳仪可分为全柱成像式的和非全柱成像式,电泳载体通常为甲基纤维素溶液。

以水平板式等电聚焦电泳仪为例,其测定等电点的方法为:首先装好水平板电泳槽,调节水平。取两性电解质、丙烯酰胺溶液、交联剂、胶凝催化剂混匀后缓慢地注入水平模具内,室温下聚合。将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放在冷却板上,其间涂以液体石蜡或煤油并避免产生气泡。用正极液与负极液分别润湿正极与负极电极条,然后分别放于阳极与阴极上,将加样滤纸放在凝胶上。加入脱盐后的待测样品溶液。将电极对准电极条的中心,加盖,在上限电压2000伏、上限电流50毫安、功率1瓦/厘米胶、温度4℃的电泳条件下开始电泳,电泳2.5小时,同时做等电聚焦标准蛋白(在电泳30分钟后去掉加样滤纸)。电泳结束后取下电泳后的凝胶,置于固定液中,用摇床摇动浸泡20分钟以上。取出固定后的凝胶,置于平衡液中,用摇床摇动浸泡20~30分钟。取出平衡后的凝胶,置于染色液中,用摇床摇动染色40~60分钟。取出染色后的凝胶,置于脱色液中,用摇床摇动洗脱,不断更换新鲜的脱色液,直至凝胶底色背景近于无色为止。取出脱色后的凝胶放入保存液中30分钟,晾干。也可做成干胶永久保存。

  • 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2015年版).北京:中国科技医药出版社,2015.
  • 王军志.生物技术药物研究开发和质量控制. 3版.北京:科学出版社,2018.

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