常用方法有十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE电泳法）、质谱法及高效分子排阻色谱法（HPSEC法）。另外还有黏度法、超速离心沉降法、光散射法等，但应用较少。

SDS-PAGE电泳法应用最为广泛。首先用还原剂及变性剂对重组蛋白进行处理，使其分子结构充分伸展并带有相同密度的负电荷。处理后的蛋白分子在电场的作用下于聚丙烯酰胺凝胶中泳动，其迁移率（单位时间泳动的距离）与分子量的对数呈线性关系，即：

lgM_W=K-bX

式中，MW为分子量；X为迁移率；k、b均为常数。通过将已知分子量的蛋白质标准的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，根据待测蛋白的迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。SDS-PAGE电泳法所需设备简单，成本低，方法重现性好，故重组蛋白药物的常规质量控制中一般采用SDS-PAGE电泳法进行分子量测定。

质谱法测定蛋白质的分子量是随着“软电离”技术的出现而逐渐发展起来的。例如，电喷雾离子化（ESI）和基质辅助激光解析离子化（MALDI），蛋白质在离子化的同时能保持完整的分子结构。蛋白质离子化后进入质量分析器，根据其在电场及磁场中的运动参数确定其分子量。质量分析器的类型有飞行时间（TOF）、四级杆（Quadrupole）、离子阱（Ion trap）、傅里叶变化离子回旋共振（FTICR）等，以TOF较为常用。质谱法测定蛋白质分子量的准确度和灵敏度都较高，可用于蛋白质的鉴定及结构确证。

HPSEC法是根据不同蛋白质流经凝胶色谱柱时表现出不同的凝胶微孔渗入能力，大分子量蛋白质渗入较浅，在色谱柱中保留时间较短；小分子量蛋白质渗入较深，保留时间较长。蛋白质分子量的对数值与其保留时间呈线性关系，据此可绘制标准曲线，将待测蛋白的实测保留时间代入即可求得其分子量。该法在重组蛋白药物的质量控制中应用相对较少。