传统的靶标识别方法，如亲和层析法，往往需要给活性小分子添加亲和标签（如生物素）、荧光标签、光化学标签及放射性核素等，其应用需要以结构和活性的关系研究为基础，比较耗时、费力。不少化学小分子没有合适的改造基团或改造后化学小分子的活性会发生显著改变，也导致该方法难以运用。此外，还需要一个合适的无活性小分子作为阴性对照，这也不容易做到。

为此，研究人员发现了一些新的非标记靶标识别方法。主要包括：①药物亲和反应的靶点稳定性分析（drug affinity response target stability; DARTS）。该方法基于小分子和蛋白质结合后，可使蛋白质对蛋白酶发生抵抗，这些未被消化的蛋白可通过质谱得到鉴定。这种方法不需要对小分子进行标记，可发现新的未知靶点。例如，FK506可在DARTS实验中保护FKBP12免受降解。缺点是对低丰度的蛋白以及膜蛋白效果不好；与DARTS原理类似的还有基于蛋白氧化速率的蛋白稳定性分析（stability of proteins from rates of oxidation; SPROX）。该方法是通过测定被氧化的蛋氨酸残基水平进而评估可能与小分子结合的蛋白质。如果活性小分子与某一蛋白结合，则会改变该蛋白的折叠状态，进而改变该蛋白中蛋氨酸发生氧化反应的速率，并通过质谱得到鉴定。该方法缺点在于小分子需要较高的浓度，不一定能反映生理状态下小分子和蛋白的结合。②细胞热力学迁移实验（cellular thermal shift assay; CETSA）。该方法基于小分子与蛋白结合后，可增加蛋白质的热稳定性。细胞或细胞裂解液分别和小分子及无活性的小分子或溶剂孵育，加热离心后，通过蛋白质印迹法比较小分子和对照组上清中目标蛋白的含量差别。优势在于可以直接衡量小分子在细胞的复杂体系中是否可以与靶标直接作用；缺点是需要高度特异性的抗体检测蛋白的改变，难以发现未知的靶标。针对未知靶标的发现问题，研究人员将CETSA和定量蛋白质组学方法结合起来（thermal proteome profiling; TPP），使CETSA也可用于未知蛋白靶标的发现，但成本较高。③基于活性小分子结构的计算机反向靶标预测。应用Pharm Mapper、Chem Mapper等计算机软件，根据药效团匹配以及结构类似化合物可能有相似的靶标的原理，预测活性小分子可能的作用靶标。该方法基于已有的靶标数据库，难以发现未知的靶标。