线粒体基质中存在由多个酶结合在一起形成的脂肪酸β-氧化酶系，在该酶系多个酶顺序催化下，脂肪酸β-氧化从脂酰基β-碳原子开始。①脱氢生成烯脂酰CoA：脂酰CoA在脂酰CoA脱氢酶^[注]催化下，从α、β碳原子各脱下一个氢原子，由FAD接受生成FADH2，同时生成反Δ2烯脂酰CoA。②加水生成羟脂酰CoA：反Δ2烯脂酰CoA在烯酰CoA水化酶^[注]催化下，加水生成L(+)-β-羟脂酰CoA。③再脱氢生成β-酮脂酰CoA：L(+)-β-羟脂酰CoA在L-β-羟脂酰CoA脱氢酶^[注]催化下，脱下2H，由NAD⁺接受生成NADH+H⁺，同时生成β-酮脂酰CoA。④硫解产生乙酰CoA：β-酮脂酰CoA在β-酮硫解酶^[注]催化下，加CoASH使碳链在β位断裂，生成1分子乙酰CoA和少2个碳原子的脂酰CoA。

经过上述四步反应，脂酰CoA的碳链被缩短2个碳原子。脱氢、加水、再脱氢及硫解反复进行，最终完成脂肪酸β-氧化。生成的FADH2、NADH经呼吸链氧化，与ADP磷酸化偶联，产生ATP。生成的乙酰CoA主要在线粒体通过柠檬酸循环彻底氧化；在肝细胞内，乙酰CoA还能转变成酮体，包括乙酰乙酸^[注]（30%）、β-羟丁酸^[注]（70%）和丙酮^[注]（微量），通过血液运送至肝外组织氧化利用。