肝、脂肪组织及小肠是脂肪合成的主要场所。体内脂肪合成在胞质溶胶中完成，以肝合成能力最强。但肝不是脂肪合成后的储存器官，合成的脂肪需与载脂蛋白B100等载脂蛋白及磷脂、胆固醇组装成极低密度脂蛋白（VLDL^[注]），分泌入血，运输至肝外组织。营养不良、中毒，以及必需脂肪酸、胆碱或蛋白质缺乏等可引起肝细胞VLDL生成障碍，导致脂肪合成后在肝细胞蓄积，发生脂肪肝。脂肪细胞可大量储存脂肪，是机体储存甘油三酯的“脂库”。

甘油-3-磷酸和脂肪酸是脂肪合成的基本原料。机体能将葡萄糖分解代谢的中间产物转化成甘油-3-磷酸，也可将甘油磷酸化生成甘油-3-磷酸；还能利用葡萄糖分解代谢中间产物乙酰辅酶A合成脂肪酸。人和动物即使完全不摄取，亦可由糖转化合成脂肪，即甘油三酯。小肠黏膜细胞主要利用摄取的甘油三酯消化产物重新合成甘油三酯，当其以乳糜微粒形式进入血液循环并被逐渐水解后，所释放的脂肪酸亦可作为脂肪组织等组织/器官合成甘油三酯的原料。脂肪组织还可水解极低密度脂蛋白甘油三酯，释放脂肪酸用于合成甘油三酯。

合成甘油三酯的三分子脂肪酸可为同一种脂肪酸，也可是3种不同脂肪酸。肝、肾等组织含有甘油激酶，可催化游离甘油磷酸化生成甘油-3-磷酸，供甘油三酯合成。脂肪细胞甘油激酶活性很低，不能直接利用甘油合成甘油三酯。脂肪酸作为脂肪合成的基本原料，须在脂肪酰辅酶A合成酶^[注]的催化下，活化成脂肪酰辅酶A^[注]才能参与甘油三酯的合成。

脂肪合成有甘油一酯和甘油二酯2条途径。①小肠黏膜细胞以甘油一酯途径合成脂肪。由脂肪酰辅酶A转移酶催化、ATP供能，将脂肪酰辅酶A的脂肪酰基转移至2-甘油一酯羟基上合成甘油三酯。②肝和脂肪细胞以甘油二酯途径合成脂肪。以葡萄糖酵解途径中间产物转变生成的甘油-3-磷酸为起始物，先合成1，2-甘油二酯，最后通过酯化甘油二酯羟基生成甘油三酯。