除意外事故引起急性毒作用外，大多数情况是环境污染物长期低剂量反复作用于人体，对健康造成慢性危害。环境污染物的长期毒性作用，可仅表现为机体对其负荷增加、临床前期的亚临床变化，也可出现临床中毒症状，甚至引起癌症、后代畸形等。寻求环境污染物对机体长期毒作用的敏感生物标志物，是评价其对健康危害的关键。

长期毒作用是毒物在生命期的全部或大部分时间内持续作用于机体而产生的。这种毒性特点是小剂量的多次摄入，引起的损害通常缓慢且细微，容易发生耐受性，也有可能通过遗传损伤后代健康。

环境污染物在体内的蓄积作用是引起长期毒作用的基础。当机体接触的环境污染物低于中毒阈剂量时，通常无明显毒作用的表现。但若环境污染物持续进入体内，机体的代谢转化排除速率低于吸收速率时，环境污染物就会在体内累积，当其蓄积量超过中毒阈剂量时，则会引发毒作用，这种现象称为物质蓄积。机体吸收环境污染物后，可能引起机体的功能或结构产生改变，若这种改变是不可修复的，或在修复过程未完成时机体又反复与该污染物接触，致使结构或功能的变化不断加深，这就是功能蓄积。因物质蓄积和功能蓄积可能为同时发生且互为基础，现有技术水平仍难以将二者区分开来。

除环境流行病学调查外，对于长期毒作用的研究主要采用动物长期毒性试验。

根据染毒时间的长短，动物长期毒性试验可分为两种：①亚慢性毒性试验。外源化学物连续染毒1～3个月的毒性试验。其主要目的是分析长期接触受试物的毒作用特征及可能靶器官，确定亚慢性毒性的最大无作用剂量或有毒作用的阈剂量，为慢性毒性研究提供依据。②慢性毒性试验。外源化学物连续染毒6～12个月或终生的毒性试验。其主要目的是确定受试物的慢性毒作用特征和靶器官，确定慢性毒性的最大无作用剂量或有毒作用的阈剂量，为受试物的危险性评价及制定环境容许浓度标准提供依据。

实验动物原则上应尽量选用敏感的、对受试物的代谢过程与人相似的动物，一般常用大鼠和犬。染毒途径应与人实际接触受试物相同，常采取经皮肤、胃肠道和呼吸道染毒。为得出明确的暴露-反应关系，一般至少设置3个受试物剂量组和1个阴性对照组。高剂量组应能使实验动物产生明显的毒性效应（但不引起动物死亡或只引起少量动物死亡）；中剂量组最好出现轻微的毒性反应，相当于观察到有害作用的最低剂量；低剂量组不出现毒性反应，相当于未观察到有害作用的最大剂量。染毒期限应根据受试物种类和实验动物生命期长短而定。在染毒期结束后，可留下部分动物继续饲养1～2个月，以观察有无迟发性中毒反应以及中毒效应的可恢复性。

合理地选择观察指标和采用灵敏、精确的检测手段是正确评价环境污染物毒作用的关键。毒性反应观察指标包括：外观及行为改变、体重增长、食物利用率、血常规检测、血液生化分析、尿液检测、脏器系数、组织病理以及对受试物毒作用敏感的特异性指标（如生物效应标志物）等。实验结果应进行统计学分析，结合暴露-反应关系和指标变化是否超出正常值范围来进行综合判断。

一般在研究长期接触外源化学物所引起的生殖与发育毒性、遗传毒性等特殊毒性作用时，会单独设计试验。致癌实验则可与慢性毒性试验结合进行，此时染毒时间应等于或接近实验动物的预期寿命。