凝胶色谱柱中装填的凝胶颗粒之间有许多孔隙，颗粒内部还存在着相对较小的微孔。另外，待分离样品中不同组分分子直径不均匀，大小分布有一定范围。当样品溶液流经垂直固定的凝胶色谱柱时，不同组分分子由于大小不一，在柱内存在两种运动方式：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。直径较大的分子，分布于凝胶颗粒之间的较大孔隙，难以进入颗粒内部的微孔，在洗脱时向下移动的速度较快。在向下移动时，较小分子可以从凝胶内部扩散到颗粒间隙中，然后再进入其他凝胶颗粒内部，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度慢于大分子物质，从而使样品中大的分子先流出色谱柱，中等的分子后流出，小分子最后流出。直径较小的分子既可以在凝胶颗粒间隙中扩散，也能穿过凝胶颗粒内部的微孔。多种成分的待分离对象通过凝胶色谱柱洗脱后，在筛孔效应作用下，按照分子大小排列，达到分离的效果。