线粒体是存在于细胞核外的细胞器。线粒体DNA（mtDNA）呈闭环双链结构（见图），只有大约16.6千碱基对（kb）长，其中编码区15447碱基对（bp），非编码的控制区1122bp。mtDNA两条反向平行的双链，因浮力密度的不同分开成外环的重链（H链）和内环的轻链（L链）。人类mtDNA具有以下特点，①母系遗传：在受精卵中几乎所有的mtDNA来自卵子，表现为母系遗传。②高拷贝数：mtDNA在一个细胞能够有多达数百到数万个拷贝。由于mtDNA含量丰富，在核DNA已降解的检材中仍可能提取到mtDNA。③异质性：一个人的mtDNA有两种或两种以上序列的情况称为异质性。异质性可以表现在同一个细胞、组织或个体中。

线粒体DNA示意图

法医mtDNA检测主要应用于缺少毛根、毛球或附着组织的脱落毛发；暴露在空气中很长时间的陈旧骨或者牙齿；核DNA检测失败的来自犯罪现场的血痕或拭子；核DNA检测失败的组织（肌肉、器官或皮肤）。基于母系遗传的特点，法医mtDNA分型也用于亲缘关系鉴定。

mtDNA多态性多集中在控制区，又称D-环区，该区域有1122个核苷酸。法医检验的经典区域是控制区包含610个核苷酸分布的HVRⅠ和HVRⅡ。随着测序技术发展，法医mtDNA分型已经开始要求对整个控制区测序。新的技术发展使得大规模进行全基因组序列分析成为了可能，即用新一代测序进行mtDNA全基因组测序，并与线粒体标准序列进行比对。

mtDNA分型结果解释分为三类：排除、不能定论、不能排除。如果未知样本序列和已知的对照序列有两个或两个以上的核苷酸的差异，可以排除来自同一人或家系；如果未知样本序列和已知的对照序列一致，则不能排除；如果未知样本序列和已知的对照序列只有一个核苷酸之间的差异，不能定论。不同组织mtDNA异质性的分析需要特别谨慎。