生于江户武士家庭。1874年入东京外国语学校学习，1877年考入北海道札幌农学校，校长W.S.克拉克是著名的自由主义教育家，教师都是基督徒，在这里内村鉴三于1878年接受基督教洗礼。1881年毕业后任职于北海道开拓使机关，负责渔业行政工作。1884～1888年赴美国阿玛斯特大学学习。

回国后，1890年任东京第一高级中学校教师。当时日本政府为推行愚民政策，把明治天皇颁布的教育纲领文件《教育敕语》进行神格化，而持反对立场的内村鉴三1891年在该校校长捧读《教育敕语》时拒绝鞠躬礼拜，被批为“大不敬事件”，1892年被解除职务。内村后去泰西学馆任教，并为德富苏峰《国民之友》杂志撰稿维生。

1897年任《万朝报》英文栏主笔，1898年创办《东京独立杂志》。在此期间内村非常关心现实的社会问题，与议员田中正造等人一起站在足尾铜矿矿毒事件斗争的前线。足尾铜山位于日本栃木县上都贺郡足尾町（今日光市足尾地区）。在江户时期就是著名的铜产地，在明治政府富国强兵政策的支持下，又得到了更大的发展，然而同时对矿山附近的环境也造成了极大的破坏。大量的废气、污水直接流入发源于足尾山区的渡良濑川，对该流域地区的生态环境造成了巨大的损害，这就是日本最初的环境公害问题——“足尾矿毒事件”。

1903年秋，日本举国陷入了对俄开战论的狂热之中，作为《万朝报》撰稿人的内村却力主和平解决日俄战争问题的非战论，由于该报支持对俄战争，内村宣布退出该报。1894年前的内村鉴三本来曾是“义战”论者，当时他对亚洲的认识与福泽谕吉等日本知识分子基本相同。他们认为西欧化等于近代化，而维新之后的日本是“文明”国家，中国等亚洲国家则是“野蛮”国家。内村1892年曾在《六合杂志》上发表过《日本的天职》一文，把日本的“天职”规定为介于“基督教的”“进取的”“共和的”“归纳的”“机械的”西洋与“佛教的”“保守的”“君主的”“演绎的”东洋之间的“媒妁者”。因为清朝阻止朝鲜对外开放，就是阻碍其近代化进程，所以日本对清朝的战争，就是文明教化野蛮的“义战”。

日俄战争后，日本由亚洲“强国”一跃成为“一等国”、世界“八大国”之一，整个社会陶醉在帝国的辉煌胜利中。然而内村鉴三看到甲午战争战后日本从中国攫取了大量赔款和土地的事实后，他的思想受到了巨大的冲击，终于认识到所谓的“义战”只不过是一个强盗在抢劫，却美其名曰“帮助邻国进步”的借口而已。所以他愤而称甲午战争是日本为了国家私欲的“欲战”，日本的行为加剧了西方国家瓜分中国的进程。

内村鉴三以超越近代国家的基督教普世原则对日本发动的甲午战争（日清战争）和日俄战争展开了激烈的批判，标志着内村已从一个“义战”主义者转变为世界和平主义者。

内村鉴三退出《万朝报》后专心从事《圣经》研究和基督教传教活动。他主张的无教会主义思想影响了一批青年，弟子有藤井武、冢本虎二、矢内原忠雄等。内村鉴三信仰两个J，Jesus（耶稣基督）和Japan（日本），即为耶稣和日本服务。主要著作有《圣书之研究》《求安录》《地人论》《基督信徒的慰藉》《我如何成为基督信徒》等。