包括信使核糖核酸（mRNA）、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA。已有的关于微生物宏转录组的研究主要以环境样品中微生物的全部mRNA为研究对象。从群体水平上研究环境微生物功能基因的表达水平及其在不同环境条件下的转录调控规律，是研究微生物与自然环境相互关系的新兴领域。2008年以来，DNA（脱氧核糖核酸）测序技术取得突破，扩大了微生物宏基因组（metagenome）研究的范围，同时也催生了核糖核酸测序（RNA-Seq）技术的出现，用于对转录组进行分析。相比于其他技术，RNA-Seq具有明显的优势，如检测范围广、无需特异性探针、高灵敏度等，使得对复杂环境样品中微生物转录组的研究变得简单易行，推动了微生物宏转录组学的发展。

基于RNA-Seq技术的环境微生物宏转录组技术已应用于水体、土壤、沉积物、动物肠道等多种生境。它的研究步骤主要包括：①环境样品的采集及保存。②总RNA的提取。③mRNA的富集。④互补DNA（cDNA）的合成。⑤高通量测序及数据分析。但是，由于环境样品中目标微生物的mRNA含量非常低，大多数情况下不能满足测序量的要求。同时，由于环境样品中存在多种杂质（如腐殖酸等）的干扰，物种组成复杂，从而加大了环境样品宏转录组研究的难度。