1910年,捷克学者E.斯塔肯斯坦[注]报道了淀粉酶在不可溶性淀粉上的选择性吸附,这是分子之间亲和作用的最初应用。1968年,夸特雷卡萨斯[注]等第一次提出“亲和层析”概念,并在配体和基体之间引入间隔臂,成功地解决了目标物和基体之间的空间位阻效应,至此,亲和层析进入快速发展阶段。
亲和层析
通过将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上,利用分子间亲和力的特异性和可逆性,对另一个分子进行分离纯化的技术。又称亲和色谱。
- 英文名称
- affinity chromatography
- 又称
- 亲和色谱
- 所属学科
- 生物学
利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力进行选择性分离,如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合等。亲和层析由基体、配体和间隔臂3部分组成,通常先在载体表面键合上一种具有反应活性的连接链(环氧、联胺等),再连接上与待分离生物大分子有亲和力的物质作为配体,即具有亲和作用的蛋白质分子与配体间具有“钥匙”和“锁孔”的立体对应关系。当样品溶液通过亲和层析柱时,待分离的生物分子与配体发生特异性结合而留在固定相上,而杂质分子不能与配体结合,随洗脱液流出。被保留在固定相上的组分,可以通过改变淋洗液的pH值或组分进行洗脱而得到分离。选择合适的配体对于亲和层析的分离效果是非常重要的,蛋白纯化中合适的配体如下(表1):
配体 | 待纯化的蛋白质 | 配体 | 待纯化的蛋白质 |
抗原 | 特定单克隆抗体或多克隆抗体 | 肝素 | 凝聚因子、脂酶、结缔组织蛋白酶、DNA聚合酶 |
单克隆抗体 | 特定抗原 | ||
蛋白质A/蛋白质G | 免疫球蛋白 | 胆固醇 | 胆固醇受体、胆固醇结合蛋白 |
蛋白酶抑制剂 | 蛋白酶 | 脂肪酸 | 脂肪酸结合蛋白、白蛋白 |
磷酸 | 磷酸酶 | 核苷酸 | 核苷酸结合蛋白、需核苷酸的酶 |
三嗪染料 | 脱氢酶、激酶、聚合酶、限制酶、干扰素 | 苯基硼酸盐 | 糖蛋白 |
凝集素 | 糖蛋白 | ||
抗生物素蛋白 | 含生物素的酶 | 糖 | 凝集素、糖苷酶 |
根据配体对目标蛋白质的亲和作用分为2类(表2):①族亲和层析。对某一类结构相近的蛋白质均表现出较强的亲和力的配体。②生物专一性配体。对某一种蛋白质表现出较强的亲和力的配体。族亲和配体按来源分为合成与天然两大类。天然配体如氨基酸、核苷酸、肝素、植物凝集素及细菌蛋白质等配体;合成类配体如染料、药物、固定化金属离子(IMAC)及分子印迹聚合物(MIP)等。
种类 | 原理 |
固定金属离子亲和层析 | 蛋白质表面的某些基团能与金属离子形成稳定的螯合物 |
染料亲和层析 | 天然或生物模拟染料对某些蛋白质的亲和吸附 |
凝集素亲和层析 | 与糖基的结合 |
生物专一性亲和层析 | 生物分子之间的专一性识别作用,如抗原-抗体、酶-底物、酶-抑制剂 |
共价亲和层析 | 利用巯基和二硫键化合物之间形成共价键 |
磁性亲和层析 | 磁性材料的磁可导向性 |
可分为配基固定化、亲和吸附、洗脱:①配基固定化。将与纯化对象有专一结合作用的物质连接在水不溶性载体上,制成亲和吸附剂。②亲和吸附。将含有纯化对象的混合物通过亲和柱,纯化对象吸附在柱上,其他物质流出层析柱。③洗脱。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱,把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱下来。
生物大分子的分离纯化中有效的手段之一,在生物化学和生物工程的产品纯化中得到了广泛的使用。主要应用于蛋白质(包括酶、抗原和抗体、各种蛋白质药物等)、核酸、细胞及病毒、多糖的分离纯化,分离效率高,可以从稀溶液或组分复杂的样品中一步得到纯度高、回收率好的目标产品。亲和层析的特异性分离可以在临床上从复杂血浆中直接得到与疾病相关的物质,在临床诊断、去除内毒素方面十分有前途,如鉴别肌酸激酶3种异构酶含量变化,用于心肌梗死等疾病的早期诊断。20世纪90年代开始,活性细胞膜层析(又称生物细胞膜层析)开始发展,主要用于药物活性成分的筛选和活性评价。亲和层析也应用在多种食品的农药残留和有害物检测中,如磺胺类、苯并咪唑类、阿维菌素类、苯乙胺类等药物残留。在兽药残留检测中,多以低分子量目标分析物为主,虽然尚处于探索阶段,但已展示了广阔的发展前景。
扩展阅读
- 郭立安,常建华.蛋白质色谱分离技术.北京:化学工业出版社,2011.
- 黄迎春.蛋白质工程简明教程.北京:化学工业出版社,2009.
- 陆健,等.蛋白质纯化技术及应用.北京:化学工业出版社,2005.