测序技术可以获得DNA上的遗传信息，进而了解基因的结构与变异，是分子生物学的重要研究手段。对核酸进行测序的仪器称为测序仪，其所采用的测序技术大致上可以分成两类：一类基于碱基互补配对原则，利用DNA的复制反应或杂交反应来推测序列；另一类则基于碱基的物理或化学性质上的差异来测定。从实际应用的角度出发，依据测序通量（通常指单次实验中所测DNA的总核苷酸数目）上的不同，测序技术常常分为“第一代测序”和“下一代测序”两代。从测量信号的来源出发，使用单分子测序原理的技术有时也被称为“第三代测序”技术。

1970年前后，吴瑞发明了引物延伸法，为核苷酸序列分析奠定基础，并于1971年测定了λ噬菌体黏性末端的完整核苷酸序列。1977年，F.桑格在引物延伸法基础上发明双脱氧核苷酸末端终止测序法，利用DNA复制反应来测定DNA的序列。通过在反应原料中分别额外添加四种双脱氧核苷酸，即缺少DNA复制所必需的3′羟基的核苷酸类似物（ddNTP），DNA复制会随机地中止在某处。对复制产物进行凝胶电泳分离，并结合所添加的ddNTP的种类，即可推断DNA的序列。例如，若添加腺嘌呤双脱氧核苷酸（ddATP）后，复制产物的凝胶电泳在50个碱基对处有条带，则可推断该DNA的第50个核苷酸为A。这一方法后来被称为“桑格测序法”。同年，W.吉尔伯特发明化学降解法，利用化学试剂有倾向地在不同碱基处裂解DNA，并借助裂解产物的凝胶电泳来推断DNA序列。1980年，吉尔伯特和桑格因为发明DNA测序技术而获得诺贝尔化学奖。1986年，L.胡德改进了桑格测序法，用荧光标记取代原有的同位素标记，用毛细管电泳及激光诱导荧光检测提高凝胶电泳的分辨率和易用性，制成了自动化DNA测序仪。经过不断改进，这一类型测序仪准确率高，所测DNA最长可达1000个碱基对以上。在早期的关键基因组测序工作如人类基因组计划中，该测序仪被广泛推广使用，极大地促进了这些物种的基因组测序完成。第一代测序技术还大量用于通量不高、对测序精度要求高的测序实践中。

又称“第二代测序”。尽管第一代测序具有准确率高的优点，但在基因组测序中仍暴露出工作量庞大、成本过高等问题。2005年起步入市场的高通量测序技术被约定俗成地称作“下一代测序”技术。下一代测序可以对极大量不同的DNA并行测序，使测序成本大幅度下降，同时可以高效产出大量数据，在基因组测序中具有极大的优势。但同时下一代测序普遍存在所测DNA长度偏短（约几百个碱基对）、测序前需对DNA做复杂处理等缺点。其典型代表之一，是美国Illumina公司于2008年发布的基于可逆循环终止原理的测序仪。该测序仪同样利用DNA复制反应来测定DNA的序列，但与桑格测序法不同的是，该测序仪使用的四种核苷酸均在3′位标记了可被特定化学反应所切除的阻遏基团，并分别在碱基上标记了不同颜色的荧光。在DNA复制时，由于核苷酸3′处标记了阻遏基团，只有一个核苷酸可以被合成进DNA新链中，通过观察荧光的颜色即可判断该核苷酸的种类，根据碱基互补配对原则即可推断DNA在此处的核苷酸种类。检测荧光确定碱基类型后，阻遏基团被切除，核苷酸3′位恢复为羟基，使得后续DNA复制反应可以继续进行，从而重复以上操作即可依次测定DNA上的核苷酸序列。该测序仪将所有待测DNA都固定在一个平板芯片的内表面上，并通过扩增使每条待测DNA序列都产生数千个相同的拷贝，从而实现信号放大，并可以通过相机扫描的方法实现数百万乃至数百亿条DNA的同时测序。其他具有代表性的下一代测序仪还包括使用焦磷酸测序法的“454测序仪”和Ion Torrent测序仪，以及利用连接酶通过碱基杂交配对进行测序的SOLiD测序仪等。

又称单分子测序。通常用于指代针对单个分子的DNA进行测序的方法。与传统的下一代测序不同，在可以实现同时测许多不同DNA的基础上，第三代测序还具有一些基于单分子测量的特点。例如，测序前处理简易，可以摆脱扩增反应带来的偏向性影响；有些方法所测DNA长度极长（数千乃至数百万个碱基对）、有些方法可直接检测碱基的表观遗传学修饰、有些方法可直接对RNA测序。然后，受限于单分子运动的随机性，它同时也有错误率较高、数据产出量不足、成本偏高等缺点。第三代测序在多倍体基因组组装、基因组的大范围结构变异检测等应用上独具优势。第三代测序技术的一个典型代表是2009年美国太平洋生物科技公司发布的单分子实时测序仪。4种脱氧核苷酸被分别标记了不同颜色的荧光基团，通过使单个DNA分子在一种称为零模波导的微孔反应器中发生连续的复制反应，利用近场光学检测实现对复制过程中不同碱基上荧光信号的读取来构建序列。另一个典型代表是2014年英国牛津纳米孔公司发布的纳米孔测序仪。该测序仪的基本原理是通过测量一条DNA单链分子在穿过一个纳米孔道时不同碱基对孔道的空间阻碍导致的穿孔电流变化来推测序列。这两种测序仪，都被证明可以用于直接测定化学修饰（如甲基化）的碱基，而纳米孔测序方法还可以针对RNA分子直接测序，无须将RNA转化成DNA再测序。

测序技术最初主要作为一种分子生物学的研究手段，用于确定基因上核苷酸的排列顺序，进而了解基因的结构与变异。但随着测序技术的发展，特别是下一代测序技术的发明与广泛使用，测序技术的应用远远超出了原有的范畴，而延伸到了临床检验、司法鉴定，甚至药物筛选、信息存储等领域。

第一代测序主要用于通量不高或对测序准确率要求高的领域，例如在克隆基因、基因分型（人类白细胞抗原分型等）、特定基因临床检验和司法鉴定中广泛应用。

大多数的测序应用，都已经广泛采用下一代测序技术。对人等高等动物的基因组进行测序，发现编码蛋白的基因仅占不到1%，剩余高达99%部分在生命活动中发挥何种作用成为现代生物学的重要课题。对不同物种的基因组进行测序并比较，可以确定它们之间的亲缘关系，构建进化树。对不同时期、不同地点发现的古人类的DNA进行测序，还可以确定人类的进化和迁徙历史。以2008～2015年进行的“千人基因组计划”为代表的大型人群测序项目，为群体遗传学的研究提供了基础数据。对重大疾病（如癌症、自身免疫病、遗传病等）患者的基因组测序，发现了大量疾病相关的基因，帮助人们了解了这些疾病的病理机制。对孕妇外周血中的游离DNA测序，可以检测胎儿的染色体倍性，预防唐氏综合征等疾病的发生。

将RNA通过逆转录转化为DNA后测序，可以获知基因的表达活跃程度和可变剪接，进而研究基因之间的调控关系。测序技术还可以鉴定DNA和RNA上的各种化学修饰，如甲基化、羟甲基化等，揭示这些化学修饰的生物学意义。将染色质中空间上相互靠近的DNA通过测序的方法进行鉴别，可以检测染色质精细的组织结构。结合染色质免疫共沉淀，测序技术还可以检测转录因子在基因组上的结合位点和染色质修饰。对单个细胞的基因组或转录组进行测序，可以鉴定出新的细胞类型，构建细胞发育谱系。

测序技术还被应用在其他很多相关领域中，将需要通过高通量技术检测的信息转化成为DNA序列信息，就可以利用下一代测序技术的成本和通量优势来解决问题。例如，传统的药物筛选工作，需要单独测试成千上万种小分子化合物能否与靶标蛋白相结合，工作量巨大。而在借助了测序的组合式药物筛选中，每个候选的小分子化合物都携带有独特的DNA条形码，一起和靶标蛋白反应。洗脱靶标蛋白后，将与靶标蛋白相结合的小分子留下，对其携带的DNA条形码进行测序即可鉴定出对应的化合物，从而大大加快了药物筛选的进程。