发源于1955年F.桑格对牛胰岛素一级结构的测定。这是生物体中第一个被测定的蛋白质的一级结构，桑格因此获得了1958年的诺贝尔化学奖。

蛋白质或多肽中氨基酸的连接顺序可以由三类不同的方法来获得，即DNA复制密码、氨基酸测序、质谱测序。由DNA密码可直接翻译读出基因蛋白质的氨基酸序列，适合于已知基因蛋白测序；氨基酸测序可用于测定未知蛋白和多肽的序列；质谱测序利用酶解片段信息进行拼接求得氨基酸顺序，可以通过软件和肽库搜索进行自动拼接。

有商品蛋白质测序仪，它结合了化学反应如埃德曼降解和离子色谱等分离技术，能对蛋白质中的氨基酸进行分离分析。

样品纯度＞97%，可用毛细管电泳纯化和检验；蛋白质分子量、亚基数已知，测得了氨基酸组成并计算出每种氨基酸的个数，测得了氨基和酰胺基含量。

蛋白质测序一般分为分解和拼合两大步：先是游离分解肽链，然后是拼合共价肽链顺序。

将蛋白质分子中共价和非共价连接的亚基或肽链游离出来，处理成可供测序用的肽段，进行测序。共有以下5个步骤：①由非共价亚基组成的多聚体（如血红蛋白为四聚体）蛋白质分子可用8摩/升尿素或6摩/升盐酸胍游离出亚基。②经二硫键连接的肽链可用氧化或还原方法断裂，共有还原保护法（不可逆方法）、直接氧化法（不可逆方法）和还原法（可逆方法）3种。③测定每摩尔蛋白质分子中末端氨基酸残基摩尔数。④分离游离后的肽链，测定各肽链的氨基酸组成，计算氨基酸分子比值，确定氨基酸组成。⑤肽链氨基酸序列测定。肽链氨基酸测序长度有限，因此需先将长肽链切短至约50个氨基酸长度，常用两种或多种不同的方法将肽切断成两套或多套肽段，并分离开来；肽链测序因末端不同，分为N-末端和C-末端，N-端分析有桑格法、埃德曼法、DNS-Cl法、酶解法等，而C-端分析有肼解法、酶降解法、硼氢化锂法等；最后进行肽段测序，即测定各肽段中的氨基酸连接顺序。

将上述数据通过推测肽链氨基酸连接顺序，确定二硫键位置，具体有以下2个步骤： ①肽链序列确定。由肽段切割方法推测已知氨基酸顺序肽段在肽链中连接次序，或由两套或多套肽段的交叉断点氨基酸顺序拼接整条肽链氨基酸顺序。②二硫键位置确定。取二硫键未断开肽链，用胃蛋白酶酶解，经双向电泳等方法分离出肽段，再用过甲酸断裂二硫键肽段，测定其组成和氨基酸顺序，最后与已测序肽段比较，即可确定二硫键位置。

分肽链水解、分离、定性定量三大步骤。水解可分为酸解、碱解、酶解三类。酸解常在105～110℃下于6摩/升盐酸或4摩/升硫酸中水解约20小时；碱解用5摩/升氢氧化钠煮沸10～20小时，蛋白酶解多形成小片段肽。酸解和酶解不产生消旋化，但酸解破坏色氨酸，小部分分解丝氨酸、苏氨酸等含羟基氨基酸，使天冬酰胺和谷氨酰胺的侧链酰胺基水解成了羧基。碱水解破坏很多氨基酸，产率不高，会部分消旋化，但可保护色氨酸不被破坏。

氨基酸可用多种方法分离和定量分析，测序中常用离子色谱法。基于C₈、C₁₈柱的液相色谱亦可用。微量分离方法如毛细管电泳或毛细管等点聚焦方法也有用处。

氨基酸也可用比色法定量分析。如若氨基酸含量高于10纳摩，可用茚三酮显色测定，它能与脯氨酸反应形成黄色化合物而与其他氨基酸生成亮紫色物质，所成颜色与氨基酸含量成正比。在10纳摩以下直至10皮摩，可用荧光胺做标记进行荧光光度测定。

埃德曼降解从N-端开始，而C-端信息能帮助确定由DNA翻译得到的蛋白的一级结构以及翻译后修饰结构，所以氨基酸末端测定很重要。有N-端和C-端测定之分，具体步骤如下：①N-端测定。将肽链与N-端选择性试剂反应，然后水解，用标准物质由色谱等分离方法测定。N-端选择反应试剂能与氨基反应的试剂种类很多，两种最常用的试剂是2,4-二硝基氟苯（桑格试剂）和丹磺酰氯。埃德曼降解试剂即异硫氰酸苯酯也可选用。如果含量合适，也可以在衍生之后由分光法测定。但不宜用离子色谱法测定。②C-端测定。C-端测定方法不如N-端测定方法多，最常用的方法是将蛋白质的N-端封闭，然后与羧肽酶反应，测定溶液光强（浓度）随时间变化的曲线。

是一种借助埃德曼降解反应的氨基酸测序方法。现有的埃德曼自动测序仪能测定约50个氨基酸序列。测序流程是：分解蛋白成肽，酶解肽链成约50个氨基酸的肽段，分离纯化所得肽段，测序各肽段，拼接已测序肽段得完整肽链一级结构。

埃德曼降解反应过程如下：用玻璃纤维包裹的凝聚胺吸附纯化过的肽链，加入12%的三甲胺和异硫氰酸苯酯（PITC）即埃德曼试剂，使与肽链N-端反应。在酸酐作用下，该N-端氨基酸脱落并异构化成乙内酰苯硫脲，可经色谱分离鉴定。重复上述操作，可以测定约50个氨基酸，每个步骤的效率约98%。

埃德曼方法不能确定二硫键位置，也不能用于N-端已被修饰或被封闭在内部的情况。

将蛋白质或肽链用内切蛋白酶酶解，取酶解溶液用色谱-电喷雾-质谱分离，测定肽碎片质谱图，借助计算机和数据库，推测氨基酸序列。重复两种或多种酶解方法，对比测序结构，即可最终确定测序。

蛋白质测序在蛋白质结构与功能研究中不可或缺，也是不同物种同类蛋白比较分析的基础。蛋白质测序的发展更趋向于DNA密码翻译法，而直接测序法更多采用质谱测序技术。质谱测序理论上不受肽链长度制约，但还需要提高长肽链质谱测定的分辨率，并提高计算机的搜索速度、扩展肽链数据库。