纳米孔测序是1995年才开始发展的新一代DNA测序的原理性新方法。

所谓纳米孔就是孔径约在1纳米的孔道，可由蛋白质分子合围而成，也可在硅片上打孔而成，还能利用石墨烯经化学反应来形成纳米孔。当向纳米孔施加电压时，会产生过孔电流，该电流与孔的形状和大小密切相关。如有分子接近或穿孔时，由于其形状、大小的不同，会阻挡电流，出现电流的特征变化。由此可能测得单链DNA穿孔时，不同碱基的电流变化，具有用于DNA测序的理论可能性。但现有的生物或固态纳米孔道一般都长于5纳米（10^-9米），可容纳10～15个碱基，尚无法检测单个碱基。另外，施加电场时还会在通道两侧各扩展出约一个通道直径的长度，即便仅考虑与单链DNA分子直径（约1.5纳米）相当的纳米孔，其对应的电场空间分辨率也只能达到3纳米，也分辨不了单碱基。为此发展了间接方法，包括杂交DNA过孔和切断碱基过孔两大类技术。前者利用单链和双链DNA过孔的电流或光学差异进行测序，又称杂交辅助纳米孔道测序技术（hybridization-assisted nanopore sequencing; HANS）。HANS以电流测序，需要利用已知序列DNA片段做探针，杂交后过孔，双链和单链的过孔电流显著不同，由此可确切分辨数杂交片段，进而由已知序列推得未知样品序列。该方法的问题是单链DNA在150毫伏产生的电场中能以大约每毫秒1个核苷酸的速度过孔，而DNA链中相邻核苷酸间隔仅0.4纳米，要在皮安（10^-12安）电流水平上检测单个核苷酸，还需减速到每毫秒1个核苷酸或更慢。电流测定的噪声也很大，故改用光学测定，但需对已知DNA探针进行碱基差异荧光标记，为再降背景，还应该标记猝灭基团，使杂交状态DNA不发荧光。如此当利用只允许单链DNA穿过的纳米孔令双链DNA穿孔时，过孔DNA要解链，使猝灭与发光基团解离，荧光再现，由波长识别检测即可读得过孔碱基序列。

第二类方法是对过孔DNA末端进行识别。用核酸外切酶逐次水解切下DNA末端的脱氧单磷酸核苷（deoxynucleoside monophosphate; dNMP），再用纳米孔逐个识别切下的dNMP来进行测序。在由α-溶血素构成的纳米孔道上键合一环糊精（形成氨基化环糊精适配体，aminocyclodextrin adaptor），就可以识别未标记的dNMP。令一个dNMP通过固定于脂双层上的氨基化环糊精修饰的α-溶血素纳米孔道时，会出现对应于A、T、G、C的4种碱基过孔电流变化，可由电流准确判断序列。其技术难点是要保证被切碱基能100%依次顺序通过纳米孔。利用穿孔时的电子隧道电流来区分碱基序列，也有一定的效果。

将一块含有纳米孔的膜浸入一电解质溶液，将溶液分割成两半，一半加入样品，而另一半不加；膜两边各置一电极，施加电场促使DNA链穿过纳米孔，同时串接皮安级电流检测器，测定过孔电流，即成纳米孔测序装置。

纳米孔测序的理论优势是只要有一根单链DNA既可以过孔测序，能省去大规模的样品制备过程，因此是一种超高速、超微量的下一代测序方法。实用化研究不少，但挑战很多，比如在电泳之外还有何种方法可以将DNA分子导入并穿过纳米孔，可以提高可操作性和操作的可靠性，探索更直接的过孔识别方法等。据预测，纳米孔测序会成为第四代测序新技术。