其测量原理是，首先将研究的分子对通过化学反应或物理吸附的方法分别连接到原子力显微镜针尖和基底表面上。然后进行单分子力谱测量，即在针尖靠近或远离基底过程中，记录针尖在竖直方向的位移和探针微悬臂的形变量，得到表征针尖与基底之间相互作用的力-距离曲线。在力-距离曲线的退针部分，随着针尖的回退，当回退力增加到临界力值（断键力）时，配体-受体复合物解离，针尖从基底突然离开，得到一个“瞬间拉断峰”，即为单分子断键力。这个拉断力的大小与此时原子力显微镜探针微悬臂的形变量x之间符合胡克定律，。

在单分子力谱实验中，通常通过控制基底表面分子的修饰密度，使针尖和样品的有效接触面积内只有一对分子发生特异性结合，对原子力显微镜所测得的拉断力值进行统计，得到拉断力，即所要测量的单分子断键力。