单分子测序技术主要有两类：基于荧光的单分子测序和基于电信号的单分子纳米孔测序。

基于荧光的单分子测序的代表为美国太平洋生物公司（Pacific Bioscience）的SMRT（single molecule real time sequencing）技术。基本原理是使用4种不同的荧光基团标记4种核苷酸，通过脱氧核糖核酸（DNA）聚合酶和模板结合，碱基配对后通过检测聚合酶掺入的核苷酸的荧光波长可判断进入的核苷酸类型。该技术利用到了一种特定的零模波导孔（zero mode waveguide; ZMW）结构，ZMW结构是由石英玻璃衬底和表面带有几十到几百纳米直径通孔的金属层构成。当孔的直径小于光的波长时，激光从小孔底部照射上去后，光强会急剧减小，激光不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在孔的底部一个小体积范围（约10^-21升）内。零模波导孔底部固定DNA聚合酶，激光能量正好覆盖需要检测的部分，能将孔外大量游离核苷酸的背景降到最低。当聚合酶检测到正确的核苷酸后，会将其掺入新生链中，这个检测过程通常需要几毫秒，而核酸链周围少量的核苷酸扩散速度非常快（约几微秒），这种时间差使掺入的核苷酸具有很高的信号强度，能在荧光标记核苷酸的背景下检测单个核苷酸掺入事件。大量的零模波导孔可以制备在同一个单分子测序芯片上有效地提高检测通量，每个孔中固定有一个DNA聚合酶，有一条DNA链在高速合成，配以高分辨率的荧光检测系统和数据记录系统，能对一个单分子测序芯片上所有孔内DNA链进行实时单分子测序分析。

基于电信号的单分子纳米孔测序技术代表为英国牛津纳米孔公司。纳米孔最早于1999年提出，是七聚体的α-溶血素在双层磷脂膜上形成的直径在1.2～2.5纳米的跨膜通道。带有纳米孔通道的膜将两个溶液隔开，当在膜两端施加电压时，带电生物分子在电场驱动下通过纳米孔通道，每个分子通过时可以引起电流的短暂降低。单分子纳米孔测序是基于腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤这4种碱基的带电性质不同，通过纳米孔造成的电流变化信号的不同来实现不同核苷酸的区分和读取的。英国牛津纳米孔公司已经推出了一系列基于α-溶血素纳米孔的单分子测序仪，包括GridION和MinION系统。除生物纳米孔外，利用固态纳米孔进行DNA测序也是研究的热点问题。固态纳米孔主要是利用硅及其衍生物加工而成，一般使用电子束或离子束在硅或其他材料薄膜表面钻出纳米尺度的孔洞，再进一步对孔的形状和大小进行修饰。相比于生物纳米孔，固态纳米孔在稳定性、电流噪声、工艺集成方面具有一定优势，更容易规模化生产。受到半导体工艺制造水平的限制，固体纳米孔的制造较为复杂和昂贵，在制造、测序和集成方面还存在许多挑战，将其运用到商业的测序产品中还有许多问题需要解决。