当一定波长的光激发时，在A检测通道发出特定波长的荧光，同时在B检测通道也会产生一定的荧光；反之，如果用另外一束不同波长的光激发时，在B检测通道发出特定波长荧光的同时，A检测通道也会观察到一定荧光，将这种光谱干扰现象称为光谱的交叉效应。光谱的交叉效应经常出现在多通道同时荧光分析、荧光互相关光谱和重合分析，它会严重地影响分析结果的准确性。通常从荧光标记探针的选择和光学系统的优化两方面进行消除（或减少）交叉效应。在荧光标记探针选择方面，尽量选择两个探针的发射波长相差较大，发射峰宽较窄，发射光谱没有重叠（或重叠部分很小）。在光学系统优化方面，选择高质量的带通滤光片将两通道的荧光分开。滤光片的带通波长越窄，两通道的交叉效应就越小，但随带通波长变窄，检测的荧光信号就变弱。实验中需要优化滤光片的配置，从而减小或消除交叉效应的影响。