最常见的荧光素酶为萤火虫荧光素酶，其发光范围从黄绿色（最大发射波长550纳米）到红色（最大发射波长620纳米）。萤火虫荧光素酶的分子结构见图。有几种不同的机理描述荧光素酶的结构对发射颜色的影响。一种机理认为所发出的光的颜色取决于酶促反应产物结构为酮式（红光）或烯醇式（绿色），另一种机理则认为氧化荧光素中苯并噻唑和苯并噻唑环之间的扭转角决定了发光颜色。研究认为激发态氧化荧光素的微环境起决定作用，荧光素酶的微环境强制氧化荧光素成更坚硬、高能结构，迫使它发出的高能量的绿光。

荧光素-荧光素酶生物发光体系在分子生物学研究领域有着重要应用，它可以极其灵敏、高效地检测基因的表达，已形成产业规模。如美国普洛麦格（Promega）公司开发了双荧光素酶报告基因技术，结合了萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，编码基因为luc，底物为D-荧光素）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase，编码基因为Rluc，底物为天然腔肠荧光素）两大基因检测系统，可以快速、简便地在单管中进行报告基因测试。

红色表示α-螺旋；蓝色表示β-折叠结构萤火虫荧光素酶三维结构