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微流控蛋白检测

/microfluidics-based protein detection/
条目作者施奇惠

施奇惠

最后更新 2023-06-06
浏览 126
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基于微流控芯片技术实现生物样本中蛋白浓度的检测。

英文名称
microfluidics-based protein detection
所属学科
化学

对于蛋白的检测方法主要包括蛋白印迹法、酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫组化、免疫荧光染色、流式细胞术、液相芯片法、质谱等。其中除质谱以外,其他方法都是通过针对蛋白的特异性抗体来实现检测的。微流控技术是通过微米尺度的结构精确控制微量液体的技术,其载体是微流控芯片,借助芯片上微米尺度的通道与物理结构来引导液体,并通过微型阀门、泵等器件来控制液体的流动与停止,因此能够实现复杂的功能,将一些生物、化学、医学分析中烦琐的样本制备、反应、分离、信号读出等基本操作集成到一块芯片上,从而实现芯片上实验室(lab-on-a-chip)的集成式检测。微流控技术主要优点在于能够用于微量液体(如血液、尿液、唾液、眼泪、脑脊髓液等)样本中蛋白浓度的检测,并能通过灵活精密的设计在蛋白检出限、灵敏度、检测速度、检测通量、易用性等方面较传统的蛋白检测方法有较大提升。

免疫层析试纸条(lateral flow immunoassay; LISA)是20世纪80年代初发展起来的一种快速免疫分析技术,也是最早的基于微流控技术原理的蛋白检测方法,其典型应用是在女性尿液中检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)的浓度来判断是否怀孕。该技术在一个试纸条上集成了样本预处理、抗原抗体结合以及信号读取等步骤,操作简单,可在几分钟内完成,是一种快速的现场检测(point-of-care testing; POCT)技术,已被广泛用于医学、司法科学、环境监测、食品安全等领域。其具体方法是:在检测血浆蛋白标志物的试纸条上,首先通过滤膜阻挡血细胞,从全血中分离出少量血浆实现了样本前处理,并通过膜的毛细作用提供动力驱动液体流动,同时在流动过程中完成了与胶体金标记一抗的孵育、与二抗的结合形成双抗体夹心法的免疫反应、胶体金显色反应实现信号读取,以及最后的质控等一系列步骤。对这一技术的后续改进主要包括用聚合物芯片来代替极为廉价的试纸条,并通过荧光、上转换发光,甚至是酶催化的气体反应等代替胶体金显色反应来实现信号的读出与数字化测量,从而提高检测的再现性以及降低方法的检出限,使其能够作为一种半定量的灵敏的蛋白浓度检测方法。而更进一步的改进则是针对原先毛细作用驱动下的液体持续单向的流动方式,通过在芯片中加入微型阀门、泵等器件来控制液体的注入与停止,通过微通道的几何设计实现不同液体的快速混合,从而在芯片上实现复杂的加样、孵育、清洗等步骤。比如基于最新微流控芯片的化学发光全自动小型化设备已经能够实现与大型化学发光设备相媲美的重复性与检出限等技术指标。

除了通过微流控技术实现集成式蛋白检测外,微流控技术的另一特点是能够对微量样本进行高通量检测。例如,人们已经能够在微量(几十微升)全血样本中快速同时检测十余种低丰度的细胞因子的方法。这一方法将一种新的单链核苷酸标记的抗体微阵列集成于微流控芯片的微通道中,并在其上游设计了快速从全血中分离血浆的几何结构,能够实现直接针对微量全血的多标志物蛋白检测,其检出限接近于临床中使用的酶联免疫吸附法(ELISA)方法。

通过微流控技术还可以实现对蛋白超灵敏检测,使传统方法不能检测或难以检测到的极低浓度蛋白成为可能。2010年由D.瓦尔特[注]等发明,并由Quanterix公司商业化。该技术将含有极低浓度蛋白的样本与大量标记了捕获抗体的磁球混合,在泊松分布的影响下,每个磁球上只捕获到至多一个蛋白分子,然后将磁球置于体积为50飞升(10-15升)的微孔中,再加入检测抗体与酶联荧光试剂实现单分子检测,最终通过计数有信号的磁球数目来计算样本中所含有蛋白的量。该技术是一种数字ELISA技术,较传统ELISA灵敏度平均提高1000倍,其超高的灵敏度已可以用于对单个细胞中的蛋白检测。

单细胞蛋白检测,尤其是低丰度的功能蛋白检测是蛋白检测方面最具挑战性的领域之一。2007年斯坦福大学R。N.扎尔[注]等首先报道了基于微流控技术的单细胞蛋白检测方法,通过在芯片中集成单细胞的分离、操作、细胞裂解、抗原抗体反应以及荧光标记等步骤,并在微通道下游用激光激发单个分子的荧光,通过高灵敏度的CCD收集,可对单个细胞中少于1000个蛋白分子进行检测。人们采用微流控技术的单细胞免疫印迹法,能够在4小时内进行几千个单细胞水平的独立免疫印迹实验。这一技术在微流控芯片中整合了单细胞分离、原位裂解、凝胶电泳、蛋白固定以及抗体检测等步骤。微流控技术一方面减少了传统免疫印迹法的开放性从而减少了蛋白在实验过程中的损失,另一方面通过微型化实现了高通量的检测。

微流控技术能够从灵敏度、检测速度、检测通量、自动化程度等多方面地提升传统的蛋白检测技术。

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