在液相色谱中对组分复杂的样品（如样品中的一个峰的容量因子值与最后一个峰的值相差几十倍至几百倍时），通常采用梯度洗脱的方法。采用梯度洗脱可以使复杂样品中性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子达到良好的分离目的。

流动相由几种不同极性的溶剂组成（如一个弱极性的溶剂A和一个强极性的溶剂B），通过改变流动相中各溶剂组成的比例从而改变流动相的极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子，并使样品中的所有组分可在最短时间内实现最佳分离。当样品随梯度起点的流动相进入色谱柱入口时，由于起点流动相中强洗脱溶剂B含量较低，化合物C1（保留性适中）和化合物C2（保留性较强）因分配系数（值）较高而滞留于色谱柱入口附近，几乎未移动。一段时间后，B增加到一定数值，C1的值达到足够小（比如小于10），其在柱中的移动速率明显增大，并且随着B的增加，其移动速率愈加快速，直到时流出色谱柱，被检测器检测到并被记录成色谱峰C1。虽然比等度时的保留时间长很多，但C1的平均值却很小，因而色谱峰并未展宽，灵敏度仍处于较高水平。随着强极性溶剂B持续增加，在随后的某个时间点，C2的值也降到10以下，C2的移动速率也开始变快，以与C1类似的方式于被洗脱出色谱柱，其平均值同样很小，色谱峰亦未展宽，灵敏度处于较高水平。

梯度洗脱具有缩短分析周期、提高分离能力、峰型得到改善、很少拖尾、增加灵敏度，但有时会引起基线漂移等特点。

①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不至于太拥挤；②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来；③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目标物的过早解吸，会引起区带扩散；而目标物的过迟解吸又会导致峰形过宽。