利用酶标记抗体或抗原，与固相化的相应抗原或抗体反应形成带有标记酶的抗原抗体免疫复合物，再利用酶对底物的高效催化作用产生有色物质，通过肉眼观察颜色深浅或分光光度计检测光吸收值（A），进而定量抗原或抗体。

为了检测微量的抗原或抗体，20世纪60年代末，L.A.施特恩贝格尔^[注]利用酶标记法建立了酶免疫技术（EIA^[注]），其原理是利用酶标记抗原或抗体，再与相应的抗原与抗体反应后，通过酶作用于底物出现的颜色反应强弱，确定抗原或抗体的量。酶促反应属于生物化学反应，具有较高的敏感性，与放射免疫所用同位素比，标记酶没有环境污染问题。但EIA的抗原抗体反应是在均质液相中，难以确定显色是源于酶标记的抗原抗体反应还是游离的酶标记抗原或抗体。因此，1971年瑞典科学家E.恩瓦尔^[注]和P.佩尔曼^[注]等又创建了非均相酶免疫技术——ELISA，是一种在固相支持物表面进行的抗原抗体反应，由于形成的酶标记抗原抗体复合物结合在固相支持物表面，而未结合的酶标记抗原或抗体则存留在液相中，通过洗涤固相物而将游离抗原或抗体与结合的抗原抗体复合物分开，进而极大地简化了操作流程。

①将抗体/抗原吸附到固相载体表面（聚苯乙烯），但抗体/抗原仍然保持其生物学活性，如吸附于聚苯乙烯板表面的抗体，其结合抗原活性不受影响。②与相应的共价连接的酶-抗体复合物反应，酶-抗体复合物中的酶活性仍保持正常，现应用较多的、酶活性保留较好的有碱性磷酸酶（AKP^[注]）和辣根过氧化物酶（HRP^[注]）等（图1）。③最后加入酶作用底物，底物被酶催化后可以进一步引起显色反应，其颜色深浅与结合在固相载体上的酶-抗体-抗原免疫复合物量成正比。以HRP催化反应为例，HRP+H₂O₂（酶作用底物）→O₂^-+DH₂（还原剂）→2D（显示剂）+2H₂O。加入底物缓冲液中的DH₂，在HRP催化H₂O₂释放的氧化剂O₂^-作用下，由无色的DH₂转化为被氧化的有色产物D。HRP常用的DH₂是邻苯二胺（OPD^[注]），AKP常用的DH₂是四甲基联苯胺（TMB^[注]）等。

图1 ELISA原理图

根据实验原理不同可以将ELISA分为直接法、间接法、双抗夹心法以及竞争法等（图2）。①直接法（图3）：是将待测抗原或抗体吸附于固相载体表面，加入酶标抗体或酶标记抗原，形成酶标抗体-抗原复合物，再加入底物显色，颜色深度与待测抗原或抗体水平成正比。②间接法（图4）：是将抗原吸附于固相载体表面，加入待测抗体形成抗体-抗原复合物，再加入酶标记抗抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物，最后加入底物显色，颜色深度与待测抗体浓度成正比。③双抗体夹心法（图5）：是最常用的检测可溶性抗原的一种方法，首先将抗原特异性抗体（capture antibody）包被在固相载体表面，加入待测抗原样品，再加酶标记抗原特异性抗体（detection antibody），形成抗体-抗原-酶标记抗体复合物，最后加入底物缓冲液显色。④竞争法（图6）：是将抗原特异性抗体包被于固相载体表面，加入酶标记抗原与未标记待测抗原，酶标记抗原和未标记待测抗原与固相载体表面抗体竞争性结合，最后加入底物显色，颜色深度与待测样本中的抗原浓度成反比，此方法可用于检测小分子抗原，如地高辛、茶碱等小分子半抗原。

图2 ELISA的分类

图3 ELISA直接法示意图

图4 ELISA间接法示意图

图5 ELISA双抗体夹心法示意图

图6 ELISA竞争法示意图

ELISA可以定性定量地检测抗原、抗体及半抗原等，具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点，现已广泛应用于免疫学、生物化学、药理学、微生物学、流行病学、传染病学及临床诊断等方面，如临床上广泛应用ELISA法检测蛋白及多肽样物质——乙型肝炎表面抗原、肿瘤标记物（癌胚抗原、甲胎蛋白等）以及内分泌激素（胰岛素、促甲状腺素、绒毛膜促性腺激素等）。ELISA也常用于检测致病菌（大肠埃希菌、霍乱弧菌、脑膜炎球菌等）、病毒（甲肝病毒、流感病毒、疱疹病毒及麻疹病毒等）以及血吸虫病与钩体病抗原等。