1997年，研究人员利用高度分化的绵羊乳腺上皮细胞，通过体细胞克隆技术生产了一只雌性小绵羊多莉（Dolly），这是第一个体细胞克隆动物，证明分化的体细胞具有全能性。随后，体细胞克隆技术先后在小鼠（1998）、牛（1998）、山羊（1999）、猪（2000）、猫（2002）、兔（2002）、马（2003）、骡（2003）、大鼠（2003）、犬（2005）、雪貂（2006）和红鹿（2007）等动物上获得了成功。

体细胞克隆的一般程序包括7个步骤（见图）：核供体细胞的准备、核受体卵子的去核、供体核的注入与融合、激活、重构胚的培养、胚胎移植、体细胞克隆个体鉴定。

克隆羊多莉的产生过程

体细胞克隆技术的关键环节。成年动物的多种体细胞，包括来源于生殖系统的细胞（如成年乳腺上皮细胞、卵丘/颗粒细胞、睾丸支持细胞等）、胎儿细胞（如胎儿成纤维细胞等）、成体生殖系统外细胞（如耳部成纤维细胞、肌肉组织细胞、鼠尾尖细胞等），以及终末分化细胞（如B/T淋巴细胞、神经细胞等）等，作为核供体细胞，已在多种动物（如绵羊、山羊、牛、猪和小鼠等）上取得成功；但不同种类的供体细胞移植效果存在差异，大量研究表明，颗粒细胞的核移植效果最好。

哺乳动物核移植的主要受体是去核的MⅡ期成熟卵母细胞，常用的去核方法包括盲吸法、荧光引导去核法、微分干涉及极性显微镜去核法、离心去核法、化学试剂去核法、末期去核法、吸引去核法、挤压去核法和点击去核法等。

按照核供体细胞注入受体卵母细胞的部位不同，供体核注入的方式分为透明带下注核法和胞质注核法：透明带下注核法，又称卵周隙注射法，是将核供体细胞注入透明带下靠近卵细胞质膜的部位，即卵周隙，适用于体积较大的供体细胞；而胞质注核法是将核供体细胞直接注入卵母细胞胞质内，适用于体积较小（＜20微米）的供体细胞。

动物体细胞核移植的最佳融合方法是电融合法，其原理是依靠直流脉冲使细胞膜产生可逆性微孔，导致膜之间的融合。该法不仅可使供体细胞与受体卵母细胞的质膜有效融合，还可激活卵母细胞，融合率较高，效果较为稳定。

电融合后，重构卵需要经过激活过程才能正常发育。重构卵的激活有化学激活法和电激活法两种：①化学激活法属于后激活，常用的激活剂包括7%乙醇、离子霉素和星形孢菌素法等。②电激活法根据激活时间不同，分为前激活、融合激活和后激活，前激活是在体细胞注入前对去核卵母细胞激活，使受体卵母细胞接收处于细胞周期各个阶段的供体核；融合激活是在电融合时给予融合电压脉冲的同时激活移核重构胚；后激活是对已融合的重构卵再次给予数个电刺激，使重构卵充分激活。

核移植重构胚的培养体系与普通体外胚胎培养体系基本相同，一般用于常规体外胚胎培养效果较好的体系均可用于重构胚的培养。

在克隆胚胎构建的同时，选择好的受体母牛进行同期发情处理，然后将体外培养至桑葚胚或囊胚阶段的克隆胚胎移植到受体牛排卵侧子宫角，一头受体牛一般移植2～3枚优质胚胎，以提高受胎率。

体细胞核移植的后代，除了要从形态、性别上鉴定供体细胞与克隆后代的亲缘关系外，还要在分子生物学水平上进行鉴定，常用方法包括分子杂交、基因组测序等。

①从生物学角度，体细胞克隆对保护物种特别是珍稀、濒危物种，以及培养优良畜种等，具有重要意义，这也是克隆技术最有价值的地方之一。②从医学角度，克隆技术可以生产出没有排斥反应的人体器官等，提高器官移植的成功率，也可以用于检测胎儿的遗传缺陷，治疗神经系统损伤等。③相对于胚胎细胞克隆，体细胞克隆的核供体来源广泛，且体细胞可以在体外进行传代培养、冷冻保存、基因修饰等操作。

体细胞克隆技术已经取得了很大进展，在猪、马、牛、羊、猴等多个物种上获得了成功，展现出广阔的应用潜力，但依然存在许多问题，主要表现在：①核移植总体效率低，成功率仅1%～3%，且克隆个体成活率低，主要表现为孕期流产率高、围产期死亡率高、出生后发病率和畸形率高等；此外，由于重构胚多种表观遗传修饰的变化，也容易导致体细胞克隆胚发育出现异常。②克隆胚胎线粒体来源问题，研究发现克隆胚胎的线粒体有可能来源于供受体双方，而细胞核基因主要来源于供体细胞，线粒体遗传基因与细胞核遗传基因的相互影响，可能与核移植总体效率低下有关。③克隆胚胎X染色体灭活易出现异常，表现为X染色体灭活方式随机或不完全现象。④伦理问题，由于担心日益成熟的克隆技术被用于人的克隆（即生殖性克隆），所以该技术自诞生之日起，就一直深陷伦理道德争论的旋涡之中。⑤在人类中，卵母细胞的获得比较困难，为其在人类医疗方面的应用带来很大的限制。

①可作为胚胎发生、死亡及其调控，细胞质与细胞核间关系，生长发育以及衰老等的重要研究手段。②可为科学研究提供大量遗传性状一致的实验动物，提高实验统计有效性，降低试验样本数目。③可用于快速扩繁良种、保护珍稀野生动物，从而加快育种进程和拯救珍稀野生动物资源。④治疗性克隆可用于医学研究和临床治疗，为治疗神经损伤、糖尿病、帕金森病等疾病提供了新的途径。⑤可广泛应用于生产多种转基因动物，建立生物工厂。