流动相极性大于固定相极性的层析类型。以非极性载体为固定相，以极性强于固定相的溶剂作为流动相，通过各组分与固定相之间产生的强疏水作用力的差异实现组分的分离。适于分离非极性、极性或离子型化合物，具有分离柱效高、分离能力强等特点，是液相层析技术常见的一类。广泛应用于氨基酸、甾类、脂肪酸、植物碱、以及生物大分子如蛋白质、酶、多肽、核酸、疫苗等分离分析领域。

一般采用表面键合了疏水基团的非极性载体为固定相，流动相是添加了甲醇、乙腈、异丙醇或四氢呋喃等有机溶剂的水或缓冲液。流动相的溶质分子受水分子的排斥作用，与带有疏水配基的固定相发生疏水作用而结合，溶质在固定相上的分配系数与其疏水性有关，疏水性越强，分配系数越大，相应的保留时间更长。溶质各组分与疏水基团之间的疏水作用力存在差异，当流动相极性降低时，这种疏水作用力减弱，疏水性弱的组分在柱内停留时间短，先被洗出，疏水性强的组分在柱内停留时间长，后被洗出，从而实现组分的分离。

种类繁多，通常以多孔硅胶为基质，通过硅烷化反应在其表面上键合非极性分子层制备得到。除了硅胶外，高分子聚合物（如聚丙烯酸酯）也可作为反相层析介质的载体。固定相对溶质的保留时间主要与固定相表面积、键合相种类与浓度等有关。一般来讲，样品在反相层析固定相上的保留值随着键合的非极性化合物链长增长或疏水性增强而增大，即：非键合硅胶＜氰基＜C₃＜C₄＜苯基 8≈C₁₈，一般优先选择C₈和C₁₈柱。继续增加碳链长度，容易导致溶质与固定相之间的疏水作用力过强，而引起生物分子的不可逆吸附和活性损失。选择反相层析介质时，除了要考虑介质疏水性，还需要考虑介质的孔道，后者与介质表面积密切相关，从而影响溶质保留值。小孔隙反相柱有利于强亲水性样品洗脱。

操作过程中，溶质间因疏水性差异实现分离，各组分保留时间除了与固定相性质，即键合相种类和密度、固定相表面积密切相关外，还与流动相性质有关。增加有机溶剂强度，洗脱强度随之增加，遵循以下规律：乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃。采用高溶剂强度、低极性流动相时溶质的保留值较低。同时需要注意控制流动相pH值，一般C₈和C₁₈柱使用的pH值范围为2～8，pH值过高会导致硅胶溶解，过低则会使键合的烷基基团发生脱落。为了提高反相层析的分离效率，当组分间极性差异很大，导致等度洗脱无法完全分离开时，常采用梯度洗脱。用反相层析分离生物活性物质时，为避免强疏水性固定相和低极性有机溶剂流动相对溶质可能产生的活性损失，需要选择适宜的固定相种类、流动相性质与操作温度等。