有些自然或人工合成的物质经波长较短的光线照射后，分子被激活，吸收能量后呈激发态。其能量除部分转化为热量或用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长的光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见光被称作荧光。生物体内有些物质受激发光照射后可直接发出的荧光，称为自发荧光，如叶绿体中的叶绿素分子受激发所发出的火红色的荧光；而本身不发荧光，在吸收荧光染料之后所发出的荧光称为次生荧光。

由于不同荧光染料（荧光素）的激发波长范围不同，因此同一样品可以同时用两种以上的荧光素标记，它们在荧光显微镜下经过一定波长的光激发可以发射出不同颜色的光。基于荧光染色的荧光显微技术在免疫学、环境微生物学、分子生物学中应用普遍，可进行菌体死活鉴定、亚细胞结构观察、物质定位以及半定量检测、病原微生物检测、环境微生物观察等。

利用荧光染料与菌体某类物质结合（例如蛋白质、DNA、RNA），在一定波长激发光的激发作用下，借助荧光显微镜对微生物样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。荧光染料包括吖啶橙、罗丹明、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein; GFP )、碘化丙啶（propidium iodide; PI）、藻红蛋白（P-phycoerythrin; PE）、4,6-联脒-2-苯基吲哚（4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI）等。在生态学研究中，荧光显微镜可以用来观察被荧光色素标记探针或荧光染料（如吖啶橙和DAPI等）处理过的微生物。被染色的微生物将发出橙色或绿色的荧光，即使是处在其他颗粒物质的内部也能被观察到。在对一个特定的菌株混合体进行处理后，可以通过激发荧光的颜色对死、活细菌进行判断，使得处在生态环境中的微生物可以在不受到干扰的情况下被观察和直接计数。

它是一种将免疫反应的特异性与荧光分子的可见性结合起来的染色方法。在一定的条件下，用化学方法（不影响抗体与抗原结合活性）将荧光素与抗体结合，然后再与相应抗原结合后，在荧光显微镜下观察抗原存在的部位，可定位，亦可用荧光计定量。常用的荧光素有异硫氰酸荧光黄、罗丹明（lissamine rhodamine B; RB2000）等。免疫荧光可在亚细胞水平上直接观察细胞结构或进行物质定位。此外，一些病原体，例如引起肺结核的肺炎分枝杆菌在使用荧光染料染色或利用免疫荧光技术进行特殊的荧光抗体标记后，可在荧光显微镜下进行鉴定。