芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子。芽孢的形态和着生部位常随细菌的不同而发生变化，既有圆形的，也有椭圆形的；有的小于母细胞，有的直径比原来的菌体还大，在分类学上具有重要意义。用显微镜观察细菌的芽孢是微生物学研究时经常进行的实验。芽孢可以用相差显微镜直接观察，也可以进行负染色后用普通光学显微镜观察，但更常用的是芽孢染色法。

与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚，通透性低且不易着色，但是芽孢一旦着色则很难脱色。利用芽孢这一性质可以先用着色能力强的染料（孔雀绿或石碳酸复红）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可以进入芽孢，水洗脱色时菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍被保留。再用对比度大的复染剂（如沙黄水溶液）染色后，菌体被染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样可将两者区别开来。

芽孢染色通常包括以下几个步骤：①制片。按常规方法涂片、干燥和固定。②加热染色。向载玻片滴加数滴5%的孔雀绿水溶液覆盖菌体，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染色液冒蒸气并维持5～10分钟，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。③脱色。待载玻片冷却后，用缓流的自来水冲洗至洗出液无色为止。④复染。用0.5%番红水溶液复染2分钟。⑤水洗。用缓流的自来水冲洗至洗出液无色为止。⑥镜检。

由于使用孔雀绿初染时需置于酒精灯上持续加热5～10分钟，不仅不易操作，加热时也可能会使染液外溅，造成污染，且染色后常出现芽孢和菌体着色度及对比度不明显并易褪色等问题。因此，也有学者对芽孢染色过程进行了改进探索。如将涂片在初染时进行沸水浴加热、烘箱加热、滤纸覆盖加热、微波炉加热、酸水解或者在初染液中添加适量表面活性剂，寻找不同染色剂的最佳浓度配比及染色时间配比（例如用10%的孔雀绿不加热直接侵染10分钟）等，以求简化并优化实验操作步骤，改善染色效果。