常规的PCR技术是用于扩增两段已知序列之间的DNA片段，而对于已知序列侧翼的未知DNA序列的扩增，则毫无办法。但是在很多时候，人们又非常渴望了解某些特征性遗传标记侧翼的序列，如转座子或病毒是整合至基因组的什么位点、某一缺失基因丢失了哪一部分、某一互补DNA（cDNA）的启动子是什么等。在反向PCR技术出现以前，对上述问题的解决办法是：一般首先用噬菌体及其衍生物做载体构建相应的基因组文库；接着用杂交的办法获得相应的阳性克隆；然后用多拷贝质粒再构建次级文库后进行杂交；最后进行测序。整个过程工程庞大。正是基于这些原因，在常规PCR的基础上建立了反向PCR，大大减少了实验的工作量，加快了实验进程。

该反应体系不是在引物之间合成DNA，而是在引物外侧合成。由于IPCR是用于扩增已知序列侧翼的DNA片段，因此其一对引物尽管与常规PCR引物一样是与已知序列互补的，但方向却是相反的。用这样一对引物进行常规PCR扩增无法得到足够的产物，因为每个引物只能对各自的模板进行线性扩增，无法进行指数级增长。所以，对用IPCR进行扩增的DNA模板必须先进行酶切，然后连接环化，使其引物方向相对，故IPCR主要包括：酶切、自身连接环化、PCR扩增、直接序列分析或克隆后再测序（见图）。

IPCR反应原理图

具体过程如下：①提取基因组DNA，用适宜的限制性内切核酸酶X进行切割。②用连接酶将酶切片段进行自身连接，形成一环状结构，从而使引物处于一个相对的位置。③先用嵌套引物的内引物b和c进行首轮PCR，然后以其PCR产物为模板，利用外引物a和d进行二轮PCR，增加PCR产物的特异性和成功率。④二轮PCR产物纯化后可直接进行序列分析或克隆后再进行序列分析。如果要得到更多的外缘片段信息，可以获得的新序列为基础，搜索新的酶切位点，进行再一轮IPCR。

如果说最初建立IPCR的目的是为了获得天然存在的转座子、病毒等在基因组中整合位点的相关遗传信息的话，那么在后基因组时代，IPCR的应用范围就大大拓宽了，例如克隆连续的基因组DNA大片段、获得启动子序列、定点诱变DNA、产生表位附加的蛋白质，鉴定插入失活基因。

宝生物工程有限公司（TaKaRa公司）推出的长链精确聚合酶链反应体外克隆试剂盒（DDR015）可以说是与IPCR技术克隆侧翼未知序列的功能相似。不同之处在于：前者取代了酶切片段的自连环化过程，代之以用特异性接头与酶切片段相连，然后用与酶切片段中已知序列同源的引物和与接头同源的引物配对进行首轮PCR，随后进行嵌套PCR增加特异性。利用该试剂盒比常规的IPCR克隆侧翼未知序列的成功率高。

在后基因组时代，基因组序列信息迅猛发展，仅在微生物领域，完成全基因组测序的种类就有70多种。进行系统诱变和功能评价是功能基因组研究的重要策略与方法，而IPCR在其中将扮演重要的角色。但是，对IPCR技术的发展并不能让人满意，其在靶序列的分离中尚无法保证成功，尽管并不复杂，但它仍是分子克隆中还存在许多问题的实验技术之一。一个重要的原因是连接获得的环状模板无论是在质量上还是在数量上都得不到保证，对于基因组复杂度大于1.0×10⁹的动植物，成功的概率较低；另一个原因在于，PCR扩增长度的限制，无论是克隆侧翼未知序列还是在DNA诱变中的应用上，能有效进行IPCR的片段一般小于4千碱基。

IPCR对克隆侧翼未知DNA序列快速有效，是常规PCR技术的重要补充，也是分子生物学技术的重要方法之一。尽管还有一些不足之处，但随着分子生物学其他技术的发展，也必将得到不断的完善。