和常规的热力学平衡（thermodynamically-balanced conventional; TBC）基因组装方法的原理类似，都是通过连续的PCR合成并组装长片段的基因序列。不同之处在于TBC不能合成一段完整的基因序列，而TBIO能够合成完整的基因序列；另外，TBC是从前往后顺序进行PCR的合成与组装，而TBIO是自内而外进行聚合酶链反应的合成与组装（见图）。

基于聚合酶链反应热力学平衡的翻转方法

在TBIO中设计引物时，正义链和反义链的引物各带有一段重复序列，并且各负责一半的基因序列的合成。当用TBIO方法合成目的基因时，会首先合成一段400～500碱基对的核心片段，可以将此片段进行胶回收后，再以此为模板进行下一轮的基因合成，以最终完全合成目的基因片段。

具体步骤如下：①引物的设计。TBIO中最为重要的一步，引物分为上下游引物，每一对对应的上下游引物都含有一段重复序列。②PCR扩增。50微升扩增体系包含：5微升10×PCR缓冲液，1微升50×脱氧核苷三磷酸mix，1微升热启动DNA聚合酶。引物最终浓度为20微摩尔，最后补水至50微升。③胶回收。当合成的目的片段达到400～500碱基对时对PCR产物进行胶回收，再以胶回收产物为模板进行下一轮合成组装。

与常规的热力学平衡基因组装方法相比，不仅能够合成完整的目的基因而且很少会发生基因的突变，因此在长片段基因序列的合成应用方面颇具前景。