在两对引物中，一对引物与靶序列的退火结合位点处于另一对引物扩增的DNA序列内，前者称为内部引物，后者称为外侧引物。一般先用外侧引物扩增一段较长的靶序列，即外部长片段（longer external fragment）。然后取1～2微升第一次扩增的产物，再用内部引物扩增其中的部分片段，又称内部短片段（见图）。套式聚合酶链反应（PCR）是为了从一个DNA模板的同一区域扩增出不同长度片段而设计的特殊方法，较常规PCR灵敏度大大提高，同时也有较强的特异性，假阴性极少。

套式/巢式PCR流程示意图

一种变异的PCR，使用两对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物称为巢式引物，结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次扩增能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，套式PCR的扩增非常特异。

反应的关键是设计合成适宜的外侧引物和内部引物。在设计引物时，必须使外侧引物的（G-C）%含量高于内部引物，往往还在外侧引物的5′端加上多个“GC”钳子（GC clamp），目的是使两种引物具有不同的解链温度，保证PCR过程中，两种引物交互引导合成两种DNA片段。