EST通常位于一段cDNA的3′端非翻译区，由于构建文库时所采用的引物差异，所测定的序列可以是cDNA的各个区段。EST代表了一个完整基因的一部分，能反映该组织或细胞中各基因的表达水平。此外，也可以将所获EST与基因数据库中已知序列进行比较，从而获得对该表达序列标签基因的功能注释。利用EST技术克隆基因及功能分析，使克隆和定位新基因的策略发生了巨大变革。

可大致分为：①提取样品的mRNA，一般为总mRNA或者带有多腺苷酸尾的mRNA。②反转成互补DNA文库，从中随机挑选克隆进行EST测序。③组装、拼接测得的EST。④和网上已有的EST数据库进行同源性比较。⑤确定EST代表的是已知基因还是未知基因。⑥检测基因的定位、结构及功能。

EST技术已经在生物学领域得到了广泛的应用：①构建遗传学图谱。EST可以直观真实地反映出表达的序列在染色体上的存在以及位置。②分离与鉴定新基因。由于已经存在大量的EST数据库，可以将测得的EST数据与数据库中已知的EST序列进行比对，迅速确定基因的位置及功能。③基因差异表达的研究。将测得的EST序列与已知EST序列进行比对后，可根据EST信息绘制出EST在不同器官及不同发育时期的时空关系谱，而一个基因表达的峰度越高，它被随机挑选出测得的EST数目就越多，因此，EST也可以作为定量基因表达量的工具。④基因的定位克隆。由于EST是从表达的mRNA反转后的cDNA中得到，所以EST标记是处于目标基因的编码区，方便了基因的定位与功能基因的筛选。⑤比较基因组学研究。利用EST数据库中古老保守序列的信息，可以研究物种间的进化关系，省去了大量的群体构建及统计分析的操作，缩短了研究周期。⑥EST与单核苷酸多态性。人类基因组中,只有约3%的序列编码蛋白质。所以对源于mRNA表达的cDNA进行测序就成为直接获得功能基因的便捷途径。⑦较为常用的核酸序列数据库有基因库（GenBank）、欧洲分子生物学实验室（EMBL）、日本国家DNA数据库（DDBJ），在它们中均存有大量EST数据。