该技术最早于2012年被提出，起源于人们对原核生物中CRISPR/Cas免疫系统的研究，该系统经改造后可应用于基因组的精确编辑，具有高效、特异、设计简单等显著优势，已广泛应用于从细菌至哺乳动物等多种不同生物的基因组编辑工作中。该技术是继锌指核酸酶（zinc finger nuclease; ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator–like effector nuclease; TALEN）技术后的第三代基因编辑技术，为基因编辑技术带来革命性的突破。CRISPR/Cas系统在细菌（约50%）和古菌（约90%）中广泛存在，可对外源遗传因子（例如病毒、质粒等）产生适应性免疫。来自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的CRISPR/Cas9系统是其中研究和应用最多的系统。2013年，CRISPR/Cas基因编辑技术被《科学》（Science）杂志评为十大科学突破第二名。2015年，该技术再度入选十大科学突破并晋升为第一名。2020年度诺贝尔化学奖也授予了CRISPR/Cas9基因编辑技术的发明者。

CRISPR/Cas系统由规律性间隔短回文序列重复簇（CRISPR）和功能相关蛋白（Cas）组成。1987年，日本科学家Y.石野良纯^[注]首次报道了大肠杆菌（Escherichia coli）基因组中存在这种特殊的重复序列结构。随着基因组测序技术的发展，人们发现这种重复序列在细菌和古菌中普遍存在，并发现了与其偶联的保守Cas蛋白。2005年，3个独立的研究团队几乎同时报道CRISPR结构中的间隔区往往与噬菌体等外源遗传因子具有序列相似性，因此推测CRISPR/Cas系统是适应性免疫系统，通过间隔区序列信息记忆入侵的外源遗传因子。2007年，法国生物化学家R.巴郎格^[注]等首次观测到嗜热链球菌从病毒基因组上获得新的间隔区，并同时获得对该病毒的抗性，从而证实了CRISPR/Cas系统的适应性免疫功能。到2010年，科学家们对CRISPR/Cas免疫应答机制有了较系统的了解。另外，CRISPR/Cas系统的结构组分和分子机制具有高度多样性，基于Cas蛋白组分多样性及分子机制等多重标准，将其定义为两大类（Class1和Class2），包括6种类型（TypesⅠ～Ⅵ），每一类型又可进一步细分为不同的亚型。

首先，Cas9在基因组DNA上快速扫描寻找原间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif;PAM）序列（一般为5′-NGG-3′），并利用指导RNA（gRNA）与靶序列之间的碱基互补配对精确识别打靶位点，然后利用其内切核酸酶活性产生DNA双链断裂（DSB）（图1b）。这种断裂一般会被细胞自身的非同源末端连接机制（NHEJ）修复，并同时引入插入或缺失突变。若提供一个外源双链供体DNA片段（donor），则可通过同源重组机制（HDR）对靶序列进行精准编辑。该技术在生命科学领域获得了广泛关注，并成功应用于各种模式生物甚至人体细胞的基因编辑。科学家们对该系统不断改造和优化，使其可用于基因表达调控、基因组成像、多重基因编辑等，拓展了其应用范围。例如，通过突变Cas9的酶切活性位点（这种变体称为dCas9），将其与转录因子结合使该系统应用于基因表达的精确调控；而通过在dCas9上添加荧光标记，可使该系统应用于活细胞基因组成像和基因定位等（图2）。但是，研究表明该技术存在一定的脱靶现象，这是该技术应用于临床的首要障碍。科学家们已提出降低脱靶效应的多种方法，主要通过两种策略：提高靶位点识别及切割的特异性、控制核酸酶表达以减少脱靶效应的积累。

a 酿脓链球菌Cas9在gRNA的引导下识别、结合并切割靶标DNA，产生双链断裂（DSB），RuvC为交叉点脱氧核糖核酸内切酶结构域，HNH为组氨酸-天冬酰胺-组氨酸核酸内切酶结构域  b 利用DSB修复系统可实现基因组编辑图1 CRISPR/Cas9基因编辑技术原理

在属于Class1的Ⅱ型系统中，Cas9是CRISPR免疫的关键蛋白质组分，有组氨酸-天冬酰胺-组氨酸核酸内切酶结构域（HNH）和交叉点脱氧核糖核酸内切酶结构域（RuvC）两个内切核酸酶结构域，可在CRISPR-RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）形成的杂合RNA双链的引导下切割双链DNA。2012年8月，美国生物学家J.A.杜德纳^[注]和法国微生物学家、遗传学家E.M.卡彭特^[注]课题组共同提出了CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术。将tracrRNA与crRNA合并成一条单一的gRNA，因此，只需gRNA和Cas9蛋白两个组分即可靶向特定的基因组位点（图1a）。2013年，美国生物学家张锋^[注]和美国基因工程学家、分子工程学家与化学家G.M.丘奇^[注]课题组几乎同时将CRISPR/Cas9应用于真核生物基因组编辑，此后该技术获得了广泛的应用。

采用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行人体细胞体外实验取得了一定成果。例如，科学家用该技术编辑囊肿性纤维化患者的人工诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell; iPS cell），通过CRISPR/Cas9基因编辑技术纠正其携带的基因突变，从而使改造后的iPSC可以分化为功能正常的呼吸道上皮细胞。此外，利用该技术直接对患病个体进行治疗已在模式动物上取得成功，例如科学家通过视网膜下注射的方式将表达Cas9及gRNA的质粒转入患病大鼠，治愈了大鼠的视网膜色素变性。另外，两项基于CRISPR/Cas9技术的癌症治疗方案分别在中国和美国通过临床试验申请。除了生物医学方面的应用，该技术在其他方面也有广阔的应用前景，例如加速农业育种改造、研制新型抗生素等。另一方面，随着新型CRISPR/Cas系统不断被发现，人们意识到该类系统蕴藏的巨大潜力。例如，CRISPR/Cpf1系统是2015年发现的，也属于Class2，该系统也可用于基因编辑，且具有以下优点：①Cpf1蛋白比Cas9更小，方便运载。②由单一RNA引导，且只需约42个核苷酸，相比Cas9系统的gRNA（约100个核苷酸）更简易。③PAM序列富含胸腺嘧啶，与Cas9系统至少包含1个鸟嘌呤的PAM在应用上可形成互补。④Cas9切割位点与识别位点重合，产生平端，而Cpf1切割位点与识别位点有一定距离，产生的黏端更便于新基因序列的引入。新类型的不断发现使CRISPR/Cas基因组编辑有更广阔的应用空间（图2）。

图2 CRISPR/Cas基因编辑技术的应用及拓展

图2中a为基因组片段删除；b为基因组片段插入；c为碱基缺失或添加；d为通过将无酶切活性的Cas9（dCas9）与转录激活因子结合实现目的基因的转录上调；e为通过将dCas9与转录阻遏因子结合实现目的基因的转录下调；f为通过蛋白融合表达等方法实现目的蛋白质的转运和定位；g为通过将dCas9与荧光基团融合表达实现染色体成像；h为通过将dCas9与表观修饰相关蛋白融合表达实现表观遗传学改造。