氨酰tRNA的合成一方面使得与tRNA结合的氨基酸本身被活化以进行下一步的肽键形成反应；另一方面使得tRNA可以携带氨基酸到信使RNA（mRNA）的指定位置，便于氨基酸掺入多肽链合适的位置上。氨酰-tRNA合成酶不仅为蛋白质的合成解决了能量问题，还解决了专一性问题。

氨酰tRNA合成酶的分子大小、亚基组成均不同，它们的一级结构同源性亦有限。根据一级结构上保守序列的特点，氨酰tRNA合成酶可以分为Ⅰ、Ⅱ两类。Ⅰ类含有两个高度保守的序列，多以单体或二聚体形式存在，它催化氨基酸结合到tRNA3′端CCA尾的腺嘌呤核苷酸的2′-羟基上。异亮氨酸氨酰tRNA合成酶、缬氨酸氨酰tRNA合成酶、谷氨酰胺氨酰tRNA合成酶等均属于Ⅰ类。Ⅱ类含有3个高度保守的序列，它催化氨基酸结合到腺嘌呤核苷酸的3′-羟基上。苏氨酸氨酰tRNA合成酶、苯丙氨酸氨酰tRNA合成酶等均属于Ⅱ类。需要注意的是，虽然苯丙氨酸氨酰tRNA合成酶属于Ⅱ类，但它催化氨基酸结合的是2′-羟基。两类氨酰tRNA合成酶与各自tRNA结合的结构示意见图1。Ⅰ类氨酰tRNA合成酶从tRNA氨基酸接受臂的小沟一侧接近对应的tRNA，紧握住反密码环，并将tRNA分子的氨基酸接受臂放置在活性中心。Ⅱ类氨酰tRNA合成酶则从tRNA氨基酸接受臂的大沟一侧接近对应的tRNA。

红色所示为tRNA，箭头所示为tRNA氨基酸接受臂，其他颜色所示为氨酰tRNA合成酶图1 两类氨酰tRNA合成酶与tRNA结合的结构

氨酰tRNA合成酶催化的氨基酸加载到tRNA上的反应称为氨酰化（aminoacylation）。氨酰化反应分两步进行，第一步是氨酰tRNA合成酶识别它所催化的氨基酸及另一底物腺苷三磷酸（ATP），在酶的催化作用下，氨基酸的羧基与ATP上的磷酸基团之间形成1个酯键，同时释放出1分子焦磷酸（PPi）：

第二个氨酰tRNA合成酶催化的反应是通过形成酯键，将氨基酸连接到tRNA 3′端CCA尾的核糖上：

上面2个由氨酰tRNA合成酶催化的反应可总结如下：

这个总反应是可逆的，但随着焦磷酸被焦磷酸酶水解成2个自由磷酸分子，上述反应就趋于完全向右进行。氨基酸与tRNA分子上的核糖之间形成的高能酯键对蛋白质合成中肽键的形成至关重要。

构成蛋白质的常见氨基酸有20种，而1种氨酰tRNA合成酶对应1种氨基酸，所以常见的氨酰tRNA合成酶也相应地有20种。虽然每一种氨酰tRNA合成酶只能识别其相对应的氨基酸，但却能识别与此氨基酸相对应的1种或多种tRNA分子。每一种特定的氨酰tRNA合成酶必须保证高保真性，才不至于把错误的氨基酸掺入到合成的蛋白质中。异亮氨酸氨酰tRNA合成酶就是具有高保真性的例子。异亮氨酸和缬氨酸只有1个甲基的差异，因此较难区别，异亮氨酸氨酰tRNA合成酶每识别150个异亮氨酸就会错误地识别1个缬氨酸。异亮氨酸氨酰tRNA合成酶除了具有催化氨酰化反应这个活性位点，还具有第二个活性位点，称为校正位点或校正部位（图2），能水解异亮氨酸tRNA与缬氨酸形成的错误酯键。经过校正反应之后，错误率会从1/150降低至1/3000。

红色所示为tRNA，蓝色所示为异亮氨酸氨酰tRNA合成酶的催化活性结构域，箭头所示为其催化位点；绿色所示为异亮氨酸氨酰-tRNA合成酶的校正活性结构域，箭头所示为校正活性催化位点；紫色所示为该合成酶其他结构域图2 异亮氨酸氨酰tRNA合成酶的催化位点和校正位点