人们普遍认为，第一个光学显微镜是1590年由两位荷兰眼镜制造者H.詹森^[注]和Z.詹森^[注]通过将两个镜片放在一个镜筒里做出的。大约在1670年，荷兰人A.van列文虎克发明了一个简单的、最大可以放大200倍的显微镜，首次实现了对单细胞（包括细菌、原生动物、肌肉细胞和精子）的观察。英国人R.胡克进一步改进了显微镜，增加了一些部件，例如放置样品的载物台、照明系统以及粗动和微动调焦机构。这些部件经过不断改进，成为现代显微镜的基本组成部分。在显微镜结构改善的同时，光学显微观察技术也在不断发展。围绕提高对比度和分辨率的问题，出现了明场、暗场、相差、微分干涉相差、共聚焦、全内反射显微镜以及超分辨显微镜等。

最基础的光学显微镜技术。一束白光透过样品后样品会吸收一部分的照射光，形成在亮背景下的暗图像。对比度来自样品对于透射光的吸收。由于生物样品吸收的光较少，通常对比度较差，因此需要通过染色来增加对比度。

利用小物体对光的散射（丁达尔效应）和衍射原理来提高对比度的光学显微镜技术。该技术利用斜射照明法阻挡透过标本细节的直射光，以散射光和衍射光来观察标本，形成在暗背景下发亮的样品效果的图像。适用于微小的、能够发生光散射和衍射的样品，例如硅藻、细菌、鞭毛、纤毛、肌动蛋白微丝和微管等。

通过将利用光线透过透明物体时产生的相位变化转化为图像中的亮度变化来观察未染色标本的光学显微镜技术。相差显微镜是荷兰科学家F.泽尔尼克^[注]于1935年发明的，泽尔尼克因此获得了1953年的诺贝尔物理学奖。相差显微镜的使用，实现了对无标记的活细胞和未染色的生物标本亚细胞结构的细微观察，对生物学研究的发展起到了重要的作用。

利用偏振光的干涉将样品厚度的微小差别转为样品明暗差别以增加对比度和立体感的光学显微镜技术。1952年，在相差显微镜基础上，波兰科学家G.J.诺马斯基^[注]发明了微分干涉显微镜。其原理是将入射光分成两束振动方向相互垂直的线偏振光，由于偏振光通过样品时会发生位移，通过样品后的两束偏振光的干涉会产生一个高对比度和显示样品结构的三维立体影像。与相差显微镜相比，微分干涉显微镜的图像立体感更强。

任何利用荧光进行成像的显微镜。包括宽场荧光显微镜、共聚焦显微镜和全内反射荧光显微镜等。其原理是通过特定波长的光来激发荧光染料或者是荧光蛋白标记的样品，使其发出和激发光波长不同的发射光，经过光学元件分光后得到由荧光形成的图像。荧光显微镜通常需要特定的激发光源例如汞灯、氙灯、发光二极管（LED）和激光，以及先进的光学检测电子器件例如电荷耦合元件（CCD）、光电倍增管（PMT）和互补金属氧化物半导体（CMOS）等（图1）。荧光显微镜的特点在于高对比度、灵敏和特异。荧光染料特别是荧光蛋白的发展使得荧光显微镜成为研究细胞生物学的强有力的工具。2008年，三位科学家下村修^[注]、M.沙尔菲^[注]和钱永健^[注]因发现和发展了绿色荧光蛋白在生物中的应用而获得了诺贝尔化学奖。

图1 荧光显微镜基本组成部分示意图

一种应用广泛的用于得到结构和动态信息的显微镜技术。荧光激发光源会同时激发整个样品，样品发射出的荧光也同时会被相机（通常是CCD或者sCMOS）所检测。这个技术的优势在于快速成像，因此常被用于活细胞的动态观察。但是由于荧光样品被同时激发，焦平面以外的荧光会降低分辨率和产生较高的背景荧光。

通过在检测器前焦平面放置一个针孔来去除非焦平面杂散光以提高空间分辨率和对比度的光学显微镜技术。它可以通过收集不同深度的样品的图像（也叫光学切片）对厚的样品进行三维重构。应用广泛的主要有激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy）和转盘共聚焦显微镜（spinning disk confocal microscopy）。激光扫描共聚焦显微镜是以激光为光源，进行逐点扫描成像，然后通过检测器（通常为PMT）进行成像。相比于宽场显微镜，激光扫描共聚焦显微镜分辨率和信噪比更高，可观察样品更厚，但同时点扫描成像也带来了成像速度慢的问题。转盘共聚焦显微镜正是为了解决这个问题而发展的。这种显微镜利用针孔阵列和CCD对于多点同时成像，因此速度更快，更适合于活细胞和动态的研究。

也称单层照明显微镜（single plane illumination microscopy; SPIM）。采用和成像物镜相垂直的片层光（通常几百纳米到几微米）进行照明（图2），通过CCD或者CMOS进行图像的采集。相比于宽场显微镜，由于只有观察的样品片层被激发，去除了非焦平面杂散光的影响，因此具有高信噪比、低光漂白、深度成像的特点，适合于活体大样品的快速成像。

图2 宽场显微镜、共聚焦显微镜和光片显微镜

全内反射荧光显微镜利用隐失波来选择性的激发样品表面薄层区域，以得到高信噪比的荧光图像。当光从光密（高折射率）介质进入光疏（低折射率）介质时，若入射角大于某个临界值，会发生全发射，但在两种介质的界面会产生隐失波。由于隐失波从界面开始指数衰减，因此只能穿透到大约100纳米以内的样品中，从而实现了对于样品表面的选择性激发成像，极大地降低了背景光噪音的干扰（图3）。全内反射荧光显微镜被广泛应用于细胞表面结构观察、细胞表面动力学如胞吞和胞吐、细胞膜钙火花和分子马达的研究等。

图3 全内反射荧光显微镜原理示意图

1873年，德国物理学家E.阿贝^[注]提出，由于光的衍射，传统的光学显微镜分辨率有一个物理极限，这个极限取决于光的波长和数值孔径。对于利用高数值孔径和可见光成像的显微镜来说这个极限大约为200纳米。超分辨显微镜技术就是突破这个衍射极限得到更高分辨率的光学成像技术。生物学中应用的较为广泛的超分辨技术有结构光照明显微术（structured illumination; SIM）、随机光学重构显微术（stochastic optical reconstruction microscopy; STORM）、光激活定位显微术（photo-activated localization microscopy; PALM）和受激发射损耗显微术（stimulated emission depleted microscopy; STED）。2014年10月8日，诺贝尔化学奖授予美国科学家E.白兹格^[注]、W.E.莫尔纳尔^[注]和德国物理学家S.W.赫尔^[注]，以表彰他们在发展超分辨荧光显微镜方面的贡献。超分辨荧光显微镜的发展使得光学显微镜进入了纳米尺度。

采用高能量超快红外脉冲激光作为激发光源，利用在高光子密度情况下荧光分子可以同时吸收两个长波长的光子而发射出短波长的荧光的原理进行光学成像的技术。双光子激发光源的波长为荧光发射波长的两倍左右，由于长波长的光可以降低样品对光的散射，可以实现活体样品与组织的深度成像。

光学显微镜的发展围绕着更深（提高成像深度）、更快（提高成像速度）和更细微（提高成像分辨率）几个方面进行。特别是超高分辨光学显微镜的发展突破了光学分辨的衍射极限，把光学显微镜技术带上了更广阔的发展道路。